李華垠，陶靜，馬依彤，劉芬，陳邦黨

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，烏魯木齊 830054；2新疆心血管病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

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FrzA基因轉(zhuǎn)導(dǎo)干預(yù)對(duì)大鼠體外缺血缺氧心肌細(xì)胞Wnt信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響

李華垠1，2，陶靜1,2，馬依彤1,2，劉芬2，陳邦黨2

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，烏魯木齊 830054；2新疆心血管病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

目的探討重組9型腺相關(guān)病毒(rAAV9)攜帶FrzA基因轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)心肌細(xì)胞缺血缺氧模型Wnt信號(hào)通路活性的抑制作用及心肌細(xì)胞凋亡的影響。方法 分離培養(yǎng)SD大鼠心肌細(xì)胞，將rAAV9攜帶FrzA基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至心肌細(xì)胞，在rAAV9表達(dá)高峰時(shí)建立心肌細(xì)胞缺血缺氧模型。隨機(jī)分為空白組、缺血缺氧組、缺血缺氧+rAAV9-CMV-eGFP組(空病毒組)、缺血缺氧+rAAV9-CMV-FrzA組 (FrzA組)。采用RT-PCR檢測(cè)各組心肌目的基因FrzA的表達(dá)；Western blotting 測(cè)定心肌細(xì)胞Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵分子Dvl-1、β-catenin、c-Myc水平及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)。結(jié)果rAAV9轉(zhuǎn)染第5天，目的基因FrzA在心肌細(xì)胞中高表達(dá)(P<0.05)。缺血缺氧組、空病毒組、FrzA組Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵分子Dvl-1、β-catenin、c-Myc表達(dá)及凋亡蛋白Bax/Bcl-2值較空白組明顯升高(P均<0.05)。FrzA組心肌細(xì)胞中Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵分子Dvl-1、β-catenin、c-Myc表達(dá)及凋亡蛋白Bax/Bcl-2值低于缺血缺氧組、空病毒組(P均<0.05)。結(jié)論 rAAV9介導(dǎo)的FrzA基因轉(zhuǎn)導(dǎo)可有效干預(yù)Wnt信號(hào)通路，抑制其活性，從而減輕心肌細(xì)胞凋亡。

心肌細(xì)胞；缺血缺氧；重組9型腺相關(guān)病毒；FrzA基因；Wnt信號(hào)通路；細(xì)胞凋亡

心肌細(xì)胞缺血缺氧是導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡、造成心肌梗死的重要病理基礎(chǔ)[1]。Wnt信號(hào)通路是一個(gè)調(diào)節(jié)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、疾病、衰老及細(xì)胞分化凋亡的重要信號(hào)通路，在動(dòng)物心臟發(fā)育過(guò)程中起到關(guān)鍵作用[2]。大量研究表明，Wnt信號(hào)通路在成人健康的心臟中是沉默的，心肌梗死后Wnt信號(hào)通路被持續(xù)激活，從而刺激細(xì)胞凋亡，加速心室重塑的進(jìn)程[3～5]。可溶性Frizzled相關(guān)蛋白1(FrzA)是一種分泌型糖蛋白，它通過(guò)與Wnt信號(hào)通路的特異性受體卷曲蛋白受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Wnt蛋白，從而抑制Wnt信號(hào)通路的活性[6]。2015年10～12月，我們建立大鼠體外心肌細(xì)胞缺血缺氧模型，觀察FrzA基因轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)心肌細(xì)胞Wnt信號(hào)通路過(guò)度表達(dá)的抑制作用及其心肌細(xì)胞凋亡的影響。

1　材料與方法

1.1材料1～3 d 新生SD乳鼠(由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)、DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))、FBS(Gibco，美國(guó))、雙抗(青霉素鏈霉素溶液)(HyClone，美國(guó))、谷氨酰胺(Sigma，美國(guó))、D-Hanks(Sigma，美國(guó))、胰蛋白酶(Sigma，美國(guó))、Ⅱ型膠原酶(Worthington，美國(guó))、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU) (Sigma，美國(guó))、恒溫離心機(jī)(Thermo，美國(guó))、二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo，美國(guó))、垂直流超凈工作臺(tái)(上海智城分析儀器制造有限公司，中國(guó))、倒置熒光顯微鏡(LEICA，德國(guó))、9型腺相關(guān)病毒(rAAV9)-GFP及rAAV9-CMV-FrzA(構(gòu)建包裝純化來(lái)自美國(guó)Virovek公司)、PCR引物(設(shè)計(jì)及合成來(lái)自上海生物工程有限公司)、PCR試劑盒(Fermentas，美國(guó))、TRIzol抽提RNA試劑盒(Invitrogen，美國(guó))。抗兔的β-catenin、c-Myc、Bcl-2、Bax、GADPH的多克隆抗體(CST，美國(guó))、抗兔的Dvl-1的多克隆抗體(Abcam，美國(guó))

1.2乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)及分組采用胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶依次消化法獲取乳鼠心肌細(xì)胞，并用差速貼壁法和化學(xué)抑制法進(jìn)行純化，分離培養(yǎng)具體方法見(jiàn)文獻(xiàn)[7]。取原代培養(yǎng)3 d的心肌細(xì)胞，隨機(jī)分空白組、缺血缺氧組、缺血缺氧+rAAV9-CMV-eGFP組(空病毒組)、缺血缺氧+rAAV9-CMV-FrzA組 (FrzA組) 。

1.3FrzA基因轉(zhuǎn)導(dǎo)將心肌細(xì)胞以每皿5×105個(gè)接種于直徑60 mm培養(yǎng)皿，用含10%FBS的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后棄去培養(yǎng)基，無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基輕洗細(xì)胞2次, rAAV9-CMV-eGFP和rAAV9-CMV-FrzA分別加入無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基中，使其覆蓋細(xì)胞表面。37 ℃、5%CO2孵育2 h后補(bǔ)加DMEM及FBS，使FBS的濃度為10%，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4心肌細(xì)胞缺血缺氧模型建立在病毒轉(zhuǎn)染第5天時(shí)建立心肌細(xì)胞缺血缺氧模型，用PBS洗滌細(xì)胞2～3次，加入模擬缺血液(無(wú)糖DMEM，并且不添加FBS)，將細(xì)胞置于三氣培養(yǎng)箱中，通入95%N2、5%CO2的混合氣體，30 min后停止通氣并密封。培養(yǎng)持續(xù)12 h。

1.5心肌細(xì)胞FrzA mRNA表達(dá)檢測(cè)采用RT-PCR法。以TRIzol法提取各組心肌細(xì)胞中的RNA后鑒定純度，反轉(zhuǎn)錄過(guò)程嚴(yán)格參照試劑盒進(jìn)行。PCR條件為:94 ℃變性2 min，根據(jù)不同引物選取不同退火溫度，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)后，再延伸5 min，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，以β-actin作為內(nèi)參，檢測(cè)心肌細(xì)胞FrzA mRNA表達(dá)。

1.6心肌細(xì)胞Wnt信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)及凋亡蛋白檢測(cè)采用Western blotting法。收集各組細(xì)胞，經(jīng)裂解提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，加樣總蛋白量40 μg，以上樣緩沖液等體積稀釋。4 ℃冰浴下SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上，常規(guī)0.05%TBST洗膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，孵育相應(yīng)一抗、二抗，然后加入顯色液，放入化學(xué)發(fā)光儀曝光。用Image lab圖像分析軟件對(duì)Western blotting圖片進(jìn)行分析，以GADPH蛋白作為參照，檢測(cè)心肌細(xì)胞Wnt信號(hào)通路相關(guān)分子Dvl-1、β-catenin、c-Myc表達(dá)。檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)，以Bax/Bcl-2值評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡情況。

2　結(jié)果

2.1各組心肌細(xì)胞FrzA mRNA表達(dá)空白組、缺血缺氧組、空病毒組、FrzA組的FrzA mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.24±0.12、0.27±0.15、0.24±0.16、2.25±0.17。與空白組、缺血缺氧組、空病毒組比較，F(xiàn)rzA組心肌細(xì)胞FrzA mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)(P均<0.05)。

2.2各組心肌細(xì)胞Wnt信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)空白組、缺血缺氧組、空病毒組、FrzA組的β-catenin相對(duì)表達(dá)量分別為0.024±0.001 2、0.083±0.003 4、0.081±0.005 7、0.058±0.002 5，Dvl-1相對(duì)表達(dá)量分別為0.13±0.025、0.29±0.034、0.28±0.037、0.15±0.023，c-Myc相對(duì)表達(dá)量分別為0.022±0.002 3、0.071±0.003 6、0.067±0.002 5、0.045±0.003 5。缺血缺氧組、空病毒組及FrzA組Dvl-1、β-catenin、c-Myc在心肌中的表達(dá)均高于空白組(P均<0.05)。與缺血缺氧組、空病毒組相比，F(xiàn)rzA組Dvl-1、β-catenin、c-Myc的表達(dá)降低(P均<0.05)。

2.3各組心肌細(xì)胞凋亡情況空白組、缺血缺氧組、空病毒組、FrzA組的Bax/Bcl-2值分別為1.25±0.45、3.52±0.41、3.47±0.39、2.26±0.49。缺血缺氧組、空病毒組及FrzA組Bax/Bcl-2值均高于空白組(P均<0.05)。與缺血缺氧組、空病毒組相比，F(xiàn)rzA組Bax/Bcl-2值降低(P均<0.05)。

3　討論

研究表明，Wnt信號(hào)通路正常情況下是沉默的，在各種病理狀態(tài)下被重新激活。在體外研究發(fā)現(xiàn)，小鼠心肌組織在缺血缺氧狀態(tài)下，Wnt信號(hào)通路被過(guò)度激活，并誘導(dǎo)了心肌細(xì)胞的凋亡[8]。本實(shí)驗(yàn)研究在細(xì)胞水平證實(shí)，與正常心肌細(xì)胞相比，在心肌細(xì)胞缺血缺氧模型中，Wnt信號(hào)通路的相關(guān)分子β-catenin、Dvl-1、c-Myc表達(dá)增強(qiáng)，說(shuō)明心肌細(xì)胞在缺血缺氧的狀態(tài)下Wnt信號(hào)通路被重新激活，心肌細(xì)胞凋亡增加。

近年來(lái)，干預(yù)Wnt信號(hào)通路從而防治心血管疾病已日益受到重視，研究人員從Wnt信號(hào)通路的不同階段對(duì)其活性進(jìn)行干預(yù)。抑制Wnt信號(hào)通路的活性，將減少心肌細(xì)胞凋亡，縮小心肌梗死面積，改善心功能[9]。然而在以前的研究中，大都是通過(guò)轉(zhuǎn)基因小鼠或基因敲出小鼠的方法干預(yù)Wnt信號(hào)通路，這樣會(huì)同時(shí)對(duì)所有組織和細(xì)胞造成影響，胚胎死亡率[10]和心梗后心臟破裂都會(huì)大大增加。研究證實(shí)，rAAV9對(duì)心肌有極強(qiáng)的靶向親和力[11]，可長(zhǎng)期穩(wěn)定地表達(dá)外源基因，是目前心臟疾病基因治療的最佳載體[12]。因此本實(shí)驗(yàn)中，我們利用rAAV9載體攜帶FrzA基因靶向干預(yù)心肌，避免了對(duì)其他組織和細(xì)胞的影響。

FrzA與Wnt信號(hào)通路中的frizzled受體有著相似的富含半胱氨酸區(qū)的分泌蛋白，因缺乏穿膜區(qū)而不能和質(zhì)膜結(jié)合，但可與間質(zhì)中循環(huán)的Wnt結(jié)合，從而阻止Wnt蛋白與質(zhì)膜上的frizzled受體結(jié)合，對(duì)Wnt信號(hào)通路起負(fù)調(diào)控作用[13]。Duplàa等[14]報(bào)道，F(xiàn)rzA基因主要在主動(dòng)脈內(nèi)皮、心臟、脾臟、眼睛、血管等組織中表達(dá)，在胚胎期血管發(fā)生早期及血管形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究證實(shí)，F(xiàn)rzA 基因的過(guò)表達(dá)能抑制小鼠急性心肌梗死后Wnt通路的激活，顯著減少心肌梗死面積，減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，增加毛細(xì)血管密度，使心臟破裂發(fā)生率降低50%，最終減輕心室重塑、改善心功能[15]。本研究在細(xì)胞水平證實(shí)，F(xiàn)rzA基因轉(zhuǎn)染可以有效抑制缺血缺氧時(shí)被激活的Wnt信號(hào)通路，使Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵分子Dvl-1、β-catenin、c-Myc水平及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax值降低，減少了缺血缺氧造成的心肌細(xì)胞凋亡，從而為基因治療缺血性心臟病提供了新的思路。

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Effects of FrzA gene transduction on Wnt signaling pathway expression and apoptosis of cardiomyocytes in rats with ischemia-hypoxia in vitro

LIHuayin1,TAOJing,MAYitong,LIUFen,CHENBangdang

(1TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China)

ObjectiveTo investigate the effects of recombinant adeno-associated virus type 9 (rAAV9) carrying FrzA gene transduction in inhibiting Wnt signaling pathway activity and on myocardial apoptosis of cardiomyocytes in rat models with ischemia-hypoxia.MethodsThe myocardial cells of SD rats were isolated and cultured. A recombinant AAV9 vector carrying FrzA gene was transfected into cardiomyocytes and then a hypoxia model was created. We divided them into four groups: control group, ischemia-hypoxia group, ischemia-hypoxia + empty virus (rAAV9-CMV-GFP) group (empty virus group) and ischemia-hypoxia + rAAV9-CMV-FrzA group (FrzA group). RT-PCR was used to detect the expression of target gene FrzA, and Western blotting was applied to detect the levels of Dvl-1, β-catenin and c-Myc as well as expression of apoptosis-related proteins Bcl-2 and Bax. ResultsOn the fifth day after virus transfection, the FrzA target gene was highly expressed in cardiomyocytes (allP<0.05). The expression of Wnt signaling pathway molecules Dvl-1, β-catenin and c-Myc was significantly higher in the ischemia-hypoxia group, empty virus group and FrzA group, and the ratio of Bax/Bcl-2 was also higher than that of the control group (allP<0.05). The expression of Wnt signaling pathway molecules Dvl-1, β-catenin and c-Myc was significantly lower in FrzA group, and the ratio of Bax/Bcl-2 was also lower than that of the ischemia-hypoxia group and empty virus group (allP<0.05).Conclusion rAAV9 carrying FrzA gene can effectively intervene the Wnt signaling pathway and inhibit its activity and thus reduce the apoptosis of cardiomyocytes.

cardiomyocytes; ischemia-hypoxia; recombinant adeno-associated virus type 9; FrzA gene; Wnt signaling pathway; apoptosis

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81470468)；新疆維吾爾自治區(qū)研究生創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(XJGRI2015064)。

李華垠(1990-)，男，住院醫(yī)師，主要從事心血管內(nèi)科疾病的診治。E-mail：332075368@qq.com

簡(jiǎn)介：馬依彤(1961-)，男，主任醫(yī)師，教授，主要從事心血管疾病基礎(chǔ)研究及臨床治療。其心血管病相關(guān)研究獲新疆維吾爾自治區(qū)科技進(jìn)步獎(jiǎng)、烏魯木齊市科技進(jìn)步獎(jiǎng)、新疆醫(yī)學(xué)科技進(jìn)步獎(jiǎng)多項(xiàng)。E-mail：myt-xj@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.33.003

R542.2

A

1002-266X(2016)33-0008-03

2016-01-14)