馮凱瑜，范明娟，譚榮榮，沈波，史薇，曾崢

(廣州市第一人民醫(yī)院老年病科，廣東廣州510180)

糞便中MGMT，p16INK4A及ECAD基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)在結(jié)直腸癌診斷中的價(jià)值

馮凱瑜，范明娟，譚榮榮，沈波，史薇，曾崢

(廣州市第一人民醫(yī)院老年病科，廣東廣州510180)

目的探討糞便中p16INK4A、ECAD及MGMT基因啟動(dòng)子甲基化在結(jié)直腸癌診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法選擇我院老年病科2014年2月至2015年11月收治的65歲以上老年健康者50例(對(duì)照組)、結(jié)直腸鏡檢查證實(shí)良性結(jié)直腸疾病者41例(良性腸病組)和結(jié)直腸癌患者46例(腸癌組)為研究對(duì)象。采用表觀遺傳學(xué)方法應(yīng)用甲基化特異PCR對(duì)上述患者糞便中p16INK4A、MGMT和ECAD基因啟動(dòng)子DNA甲基化進(jìn)行檢測(cè)，判斷上述標(biāo)本中各基因啟動(dòng)子的甲基化水平。根據(jù)p16INK4A、MGMT和ECAD基因啟動(dòng)子DNA甲基化水平，評(píng)價(jià)其作為診斷結(jié)直腸癌的敏感性和特異性。結(jié)果對(duì)照組、良性腸病組和腸癌組p16INK4A基因啟動(dòng)子DNA甲基化率分別為14.0%、24.4%和71.7%；MGM基因甲基化率分別為16.0%、14.6%和54.3%；ECAD基因甲基化率分別為12.0%、19.5%和65.2%。上述基因啟動(dòng)子甲基化率在腸癌組明顯高于對(duì)照組和良性腸病組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；p16INK4A、MGMT和ECAD診斷腸癌的敏感性分別為0.72、0.54和0.65，特異性分別為0.76、0.75和0.80。結(jié)論p16INK4A、MGMT和ECAD基因啟動(dòng)子甲基化發(fā)生率在腸癌患者糞便中顯著增高，可作為腸癌診斷的分子標(biāo)志物。

糞便；p16INK4A；MGMT；ECAD基因；甲基化；腸癌；診斷；敏感性；特異性

結(jié)直腸癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率較高的實(shí)體惡性腫瘤，近年來(lái)我國(guó)居民生活飲食習(xí)慣及生活方式日趨西方化，致結(jié)直腸癌發(fā)病率出現(xiàn)上升趨勢(shì)。來(lái)自我國(guó)的臨床流行病數(shù)據(jù)顯示，結(jié)直腸癌死亡率居第4位，僅次于肺癌、胃癌和乳腺癌[1]，因此，探尋結(jié)直腸癌有效的診斷方法，做到早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防早治療，是臨床工作的重點(diǎn)。近年來(lái)腫瘤的表觀遺傳學(xué)研究進(jìn)展對(duì)結(jié)直腸癌的診斷和治療具有深遠(yuǎn)的意義[2]。有證據(jù)表明抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島高度甲基化是基因失活的一個(gè)重要機(jī)制。同時(shí)在多種腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)抑癌基因啟動(dòng)子甲基化發(fā)生頻率顯著增高，提示其可作為診斷結(jié)直腸癌的標(biāo)志物。本文就糞便中p16INK4A、ECAD及MGMT基因啟動(dòng)子甲基化用于結(jié)直腸癌診斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2014年2月至2015年11月我院老年病科收治的65歲以上行結(jié)腸鏡檢查未見器質(zhì)性病變者50例(對(duì)照組)、結(jié)直腸鏡病理檢查證實(shí)良性結(jié)直腸疾病者41例（良性腸病組）和結(jié)直腸癌患者46例（腸癌組）為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)對(duì)照組：年齡＞65周歲；既往無(wú)結(jié)直腸疾病病史；腸鏡檢查未發(fā)現(xiàn)器質(zhì)病變；排除既往有消化系統(tǒng)惡性腫瘤病史、其他腫瘤病史和精神疾病病史者。(2)良性腸病組：年齡＞65周歲；結(jié)腸鏡檢測(cè)為良性腸病，包括腸炎、結(jié)直腸息肉等；排除既往有惡性腫瘤病史和精神疾病病史者。(3)腸癌組：年齡＞65周歲；腸鏡及病理學(xué)檢查提示為結(jié)直腸癌；排除有精神疾病病史和有其他惡性腫瘤病史者。

1.2 儀器與試劑多功能PCR儀(DNA Engine)：BIO-RAD公司，購(gòu)自美國(guó)；紫外凝膠成像系統(tǒng)：BIO-RAD公司，購(gòu)自美國(guó)；臺(tái)式離心機(jī)(AllegraX-22R)：Beckman公司，購(gòu)自美國(guó)；DNAMarker DL2000，購(gòu)自日本TaKaRa公司；Gold ViewTMDNA染料規(guī)格：1 mL/支，購(gòu)自北京賽百盛；DNA提取試劑盒，Qiagene DNA blood minikit(50T)Qiagene；Qiagene DNA blood and tissue kit(50T)Qiagene QIAGENE公司，購(gòu)自德國(guó)；亞硫酸鹽修飾試劑盒，EZ DNA Methylation-Gold?Kit，Catalog Nos.D5006(200rxns)ZYMO公司，購(gòu)自美國(guó)。

1.3 標(biāo)本采集及DNA提取對(duì)入組患者進(jìn)行糞便標(biāo)本收集，取患者糞便0.5 g，根據(jù)Qiagene DNA stool minikit操作說(shuō)明提取DNA。

1.4 甲基化特異PCR反應(yīng)DNA堿基亞硫酸鹽修飾后純化回收，進(jìn)行甲基化特異PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為：總體積為25 μL，具體為：TaKaRa Taq EX Hot Star Version(5 U/μL)0.25 μL，10×PCR Buffer(Mg2+) 2.5 μL，dNTPMixture(各2.5 mol/L)2 μL，PrimerF 0.5 μL (10 μmol/mL)，PrimerR 0.5 μL(10 μmol/mL)，模板DNA2 μL，滅菌蒸餾水17 μL，序列見表1。

表1 三個(gè)基因甲基化引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用Stata9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組標(biāo)本p16INK4A、MGMT和ECAD甲基化檢測(cè)結(jié)果比較將PCR產(chǎn)物5 μL進(jìn)行凝膠垂直板電泳，后行g(shù)oldview染色，甲基化引物擴(kuò)增有條帶說(shuō)明發(fā)生甲基化改變，如圖1所示，腸癌組2、5、6、8、9、10及12號(hào)標(biāo)本發(fā)生甲基化改變；對(duì)照組2、3、4及10號(hào)標(biāo)本發(fā)生甲基化改變；良性腸病組2、6、10和12號(hào)標(biāo)本發(fā)生甲基化改變。

圖1 甲基化PCR電泳圖

2.2 三組標(biāo)本甲基化水平比較對(duì)照組、良性腸病組和腸癌組p16INK4A基因啟動(dòng)子DNA甲基化率分別為14.0%、24.4%和71.7%；MGMT基因甲基化率分別16.0%、14.6%和54.3%；ECAD基因甲基化率分別12.0%、19.5%和65.2%。上述基因啟動(dòng)子甲基化率在腸癌組顯著高于對(duì)照組和良性腸病組，且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 三組標(biāo)本各基因甲基化水平[例(%)]

2.3 各基因甲基化診斷結(jié)直腸癌的價(jià)值分別以p16INK4A、MGMT和ECAD基因啟動(dòng)子DNA甲基為參考，以病理診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)上述基因甲基化改變用于診斷腸癌的敏感性和特異性。p16INK4A、MGMT和ECAD診斷腸癌的敏感性分別為0.72，0.54和0.65，特異性分別為0.76、0.75和0.80，見表3。

表3 各基因甲基化診斷腸癌的敏感性和特異性(例)

3 討論

目前，我國(guó)50歲以上老齡人口為2.56億，占總?cè)丝?9.5%，具有結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)的人群超過(guò)1億[3]。故高齡人群進(jìn)行全面結(jié)直腸癌篩查，對(duì)于結(jié)直腸癌的早期診斷、早期治療，提高結(jié)直腸癌的預(yù)后至關(guān)重要。但我國(guó)目前現(xiàn)有的衛(wèi)生資源、經(jīng)濟(jì)條件等無(wú)法滿足對(duì)所有人群進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查或乙狀結(jié)腸鏡檢的要求，所以使用直接的篩查手段對(duì)高危人群進(jìn)行檢查并不現(xiàn)實(shí)。因此，探尋一種簡(jiǎn)單而敏感性較高的結(jié)直腸癌高危人群初篩指標(biāo)，并根據(jù)初篩結(jié)果對(duì)陽(yáng)性人群采用結(jié)直腸鏡檢查，這種結(jié)直腸癌篩查方法避免了盲目大規(guī)模腸鏡篩查帶來(lái)的弊端和可行性較差等缺點(diǎn)，同時(shí)也節(jié)約了醫(yī)療資源，提高了結(jié)直腸鏡檢查的陽(yáng)性率。

近年來(lái)腫瘤的表觀遺傳學(xué)研究進(jìn)展對(duì)結(jié)直腸癌的診斷和治療具有深遠(yuǎn)的意義。有證據(jù)表明抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島高度甲基化是基因失活的一個(gè)重要機(jī)制，不同基因的轉(zhuǎn)錄失活將產(chǎn)生不同的后果，如影響細(xì)胞周期、DNA修復(fù)、致癌物代謝、細(xì)胞粘附、凋亡等。在多種人類惡性腫瘤中，抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島呈現(xiàn)不同程度的甲基化，并導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄沉默[4-5]。已有研究顯示，在結(jié)直腸癌患者中，基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島甲基化是一個(gè)較為普遍的現(xiàn)象[6]。如p16INK4A[7-8]、MGMT[9-10]、ECAD基因DNA啟動(dòng)子甲基化在大多數(shù)結(jié)直腸癌患者腫瘤細(xì)胞中能夠檢測(cè)到，而基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)相對(duì)容易[11]。因此采用腸癌高危人群糞便作為研究材料，應(yīng)用貝葉斯定理綜合評(píng)價(jià)各種啟動(dòng)子甲基化模式用于診斷結(jié)直腸癌，對(duì)于提高結(jié)直腸癌的預(yù)后具有重要意義。

在本研究中筆者通過(guò)比較65歲以上健康人群、良性腸病患者及腸癌患者糞便中p16INK4A、MGMT、ECAD基因啟動(dòng)子的甲基化情況，探討其作為分子標(biāo)志物診斷腸癌的臨床價(jià)值。研究結(jié)果認(rèn)為，腸癌患者糞便中p16INK4A、MGMT、ECAD甲基化頻率顯著高于良性腸病組與健康人群。同時(shí)，分別以p16INK4A、MGMT和ECAD基因啟動(dòng)子DNA甲基為參考，以病理診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)上述基因甲基化改變用于診斷腸癌的敏感性和特異性，p16INK4A、MGMT和ECAD診斷腸癌的敏感性分別為0.72、0.54和0.65，特異性分別為0.76、0.75和0.80。p16INK4A基因的敏感性和特異性均較高，ECAD和MGMT基因的特異性較高，而敏感性較低。

綜上所述，綜合糞便中多個(gè)抑癌基因啟動(dòng)子甲基化結(jié)果，有望提高結(jié)直腸癌診斷的臨床效果，提高結(jié)直腸癌的早期診斷率降低結(jié)直腸癌的死亡率，整體提高結(jié)直腸癌的預(yù)后。

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Clinical value of MGMT,p16INK4Aand ECAD gene promoter methylation in the diagnosis of colorectal cancer.

FENG Kai-yu,FAN Ming-juan,TAN Rong-rong,SHEN Bo,SHI Wei,ZENG Zheng.Department of Geriatrics,Guangzhou First People's Hospital,Guangzhou 510180,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the clinical value of MGMT,p16INK4Aand ECAD gene promoter methylation in the diagnosis of colorectal cancer.MethodsFifty healthy people of more than 65 years old(control group),41 patients of benign colorectal disease(benign colorectal disease group)and 46 patients with colorectal cancer(colorectal cancer group)in Department of Geriatrics from February 2014 to November 2015 were included in this study.The methylation levels of p16INK4A,MGMT,ECAD gene promoter in the stool of the three groups were assayed by methylation specific PCR.The diagnostic value of the p16INK4A,MGMT and ECAD methylation were calculated according to the Baye's equation.ResultsThe methylation rates were 14.0%,24.4%and 71.7%for p16INK4Agene in the three groups,16.0%, 14.6%and 54.3%for MGMT gene,and 12.0%,19.5%and 65.2%for ECAD gene respectively,with statistically significant difference between colorectal cancer group and benign colorectal disease group,control group(P＜0.05).The diagnostic sensitivity was 0.72,0.54 and 0.65,respectively,and the specificity was 0.76,0.75 and 0.80 for p16INK4A, MGMT and ECAD,respectively.ConclusionThe methylation rate of p16INK4A,MGMT and ECAD gene promoter in colorectal cancer patients'stool are significantly increased,which can be used as a molecular marker for colorectal cancer diagnosis.

Stool;p16INK4A;MGMT;ECAD gene;Methylation;Colorectal cancer;Diagnosis;Sensitivity;Specificity

R735

A

1003—6350（2016）21—3461—03

2016-05-24)

廣東省廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目(編號(hào)：20151A010002)

馮凱瑜。E-mail：fengkaiyu77@163.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.21.007