王 靜，劉成倩，李 紅，易建中*，于宗幸，陳 磊，孫曉云

（1上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海201106）

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豬圓環(huán)病毒2型Rep基因真核表達載體的構(gòu)建和免疫原性分析

王 靜1，2，劉成倩2，李 紅2，易建中2*，于宗幸1，2，陳 磊1，2，孫曉云1，2

（1上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海201106）

摘 要：根據(jù)GenBank發(fā)表的豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）基因序列設(shè)計并合成1對特異性引物，進行PCR擴增，從PCV2突變株中擴增出PCV2 Rep基因，對PCR擴增產(chǎn)物清潔后進行雙酶切，連接到pEGFP-C1載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)PCR篩選和測序后鑒定出正確的重組基因，完成真核表達載體的構(gòu)建。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到PK15細(xì)胞中，收取病毒液抽提DNA，PCR檢測到Rep基因，證明轉(zhuǎn)染是成功的。進行間接免疫熒光試驗，可以檢測Rep基因在PK15細(xì)胞中的表達，試驗結(jié)果很好的驗證了Rep基因的免疫原性。這為進一步研究PCV2的生物學(xué)活性及PCV2新型疫苗奠定了堅實的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒2型；Rep基因；真核表達載體；間接免疫熒光

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）是已知的最小的動物病毒之一，為單股環(huán)狀DNA病毒［1］。根據(jù)其抗原性和基因組組成的不同，可分成2種類型，即PCV1和PCV2［2-3］。PCV1沒有致病性，研究的不多；PCV2有致病性，可經(jīng)口腔、呼吸道等多種途徑感染不同年齡的豬［4］，引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）。此病目前呈世界性分布［5］，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的損失。并且PCV2能夠破壞豬體免疫系統(tǒng)，形成免疫抑制，誘發(fā)多種病原混合感染或繼發(fā)感染，導(dǎo)致難以控制的嚴(yán)重疾病［6］。

PCV2病毒有11個開放閱讀框，即OPF1—ORF11，其中，ORF1和ORF2是主要的2個閱讀框。ORF1是最大的開放閱讀框，位于核苷酸的正鏈上，編碼病毒的復(fù)制酶蛋白（Rep），參與病毒的復(fù)制［7］。PCV2 Rep基因的大小為945 bp，編碼314個氨基酸，具有嚴(yán)格的保守性［8］。

本研究通過PCR方法擴增出Rep基因，并克隆到真核表達載體pEGFP-C1上，轉(zhuǎn)染到PK15細(xì)胞中，研究Rep基因在PK15細(xì)胞上的表達特性，建立豬圓環(huán)病毒間接免疫熒光技術(shù)。此技術(shù)具有良好的敏感性和特異性，可為PCV2疫苗提供必要的抗體檢測方法，進一步為PCV2疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

感受態(tài)細(xì)胞DH5α、PCV2全基因組突變質(zhì)粒、真核表達載體pEGFP-C1均為上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所禽病防控研究室保存。內(nèi)切酶AgeⅠ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶均購自Thermo Scientific公司。高保真PCR擴增KOD酶購自TaKaRa公司。Taq DNA聚合酶購自北京全式金生物公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?2000 Reagent購自Lifetech公司。

1．2 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank發(fā)表的PCV2基因序列（登陸號：DQ180392" 1）設(shè)計并合成Rep基因的特異性引物，在引物的上、下游分別加入AgeⅠ、XhoⅠ這兩個酶切位點。引物序列為：

PCV-Rep-F（AgeⅠ）：5’-GTATGACCGGTCGCCACCATGCCCAGCAAGAAGAGTGG-3’；

PCV-Rep-R（XhoⅠ）：5’-TTCGACTCGAGTCAGTAATTTATTTCATATGGAAAT-3’。

引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1．3 PCV2 Rep基因的PCR擴增

以PCV2全基因組突變質(zhì)粒為模板進行PCV2 Rep基因的PCR擴增。擴增體系為質(zhì)粒稀釋10倍作為模板取2 μL，10×Buffer（Mg2＋free）5 μL，dNTP（2 mmol/L）5 μL，MgSO44 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1" 5 μL，KOD酶2 μL，ddH2O 29 μL，操作時在冰上進行。PCR的反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性40 s，56℃退火30 s，68℃延伸90 s，35個循環(huán)；68℃再延伸10 min。PCR結(jié)束后取5 μL在1％瓊脂糖凝膠電泳，用紫外分析儀觀察條帶大小，判斷是否為目的條帶。

1．4 PCV2 Rep基因的真核表達載體的構(gòu)建和鑒定

用限制性內(nèi)切酶AgeⅠ和XhoⅠ分別對PCV2 Rep基因的PCR清潔產(chǎn)物和表達載體pEGFP-C1雙酶切，取3 μL瓊脂糖電泳，觀察目的條帶正確后，將純化回收的PCR清潔產(chǎn)物與載體pEGFP-C1連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。通過PCR篩選出含有目的片段的重組菌，送到鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司測序。取測序正確的抽提質(zhì)粒，命名為C1-Rep，雙酶切確定重組質(zhì)粒的正確性。

1．5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞

將在96孔、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上制備的長成單層的PK15細(xì)胞各以PBS沖洗2次，按照轉(zhuǎn)染說明書，將經(jīng)過轉(zhuǎn)染試劑處理的重組質(zhì)粒分別加入細(xì)胞培養(yǎng)板孔，編號。37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約6 h，換加2％血清的DMEM細(xì)胞液，再培養(yǎng)72 h。同時設(shè)立不轉(zhuǎn)染的正常PK15細(xì)胞作陰性對照。PCV病毒液感染作為陽性對照。

1．6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞的檢測

在培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后，將24孔板直接放入－80℃冰箱，反復(fù)凍融3次后，2 000 g離心10 min，取上清，用酚氯仿法抽提DNA。

以抽提的DNA為模板進行PCR檢測，引物采用PCV2-Rep-F/R，模板取4 μL，10×Buffer（Mg2＋）2" 5 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，Taq酶0" 3 μL，加ddH2O補至25 μL。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物5 μL在1％瓊脂糖膠上電泳。

1．7 免疫熒光試驗

將96孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液倒去，于各孔中加入100 μL－20℃預(yù)冷的75％乙醇，4℃放置0" 5 h固定。隨后，棄去乙醇，PBS洗滌2次，務(wù)必使有機溶劑揮發(fā)干凈。之后，用5％脫脂奶粉在37℃恒溫培養(yǎng)箱中封閉50 min。結(jié)束后，每孔加入100 μL用5％脫脂奶稀釋的PCV一抗，稀釋比例為1∶1 500，37℃作用1" 5 h。PBS洗3次后每孔加入一定稀釋度的FITC標(biāo)記山羊抗豬IgG，37℃避光作用1 h。PBS洗3次后甩干，鏡檢。

2 結(jié)果與分析

2．1 PCV2 Rep基因的PCR擴增

以PCV2全基因組質(zhì)粒為模板，以PCV2-Rep-F、PCV2-Rep-R為引物進行PCR擴增，擴增得到的片段全長約為945 bp（圖1），與預(yù)期片段相符。

圖1　PCV2-Rep基因的PCR擴增Fig．1 PCR amplification of PCV2-Rep gene

2．2 C1-Rep基因的真核表達載體的構(gòu)建和鑒定

將pEGFP-C1質(zhì)粒與PCV2 Rep基因的PCR擴增產(chǎn)物分別用Age I和Xho I雙酶切連接后，挑取轉(zhuǎn)化后的菌落進行PCR篩選，在1％瓊脂糖凝膠中點樣電泳，能檢測到約945 bp的基因片段即陽性菌（圖2）。

經(jīng)測序正確后的陽性菌接菌后提取質(zhì)粒，分別用Age I和Xho I進行雙酶切鑒定，得到約4 731 bp和945 bp 2個片段，分別與載體和Rep基因的長度一致（圖3）。

圖2　重組質(zhì)粒陽性菌的篩選電泳圖Fig．2 Screening electropherogram of recombinant plasmid’s Gram-positive bacteria

圖3　重組質(zhì)粒的酶切鑒定電泳圖Fig．3 Enzyme digestion electropherogram of recombinant plasmid

2．3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞的檢測

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞后，經(jīng)過72 h的培養(yǎng)反復(fù)凍融后收取上清液，提取上清液中的DNA，用PCR方法檢測。通過在1％瓊脂糖凝膠中點樣電泳，在C1-Rep重組質(zhì)粒和陽性對照中均觀察到約945 bp的基因片段，陰性對照則無。說明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞后收取的上清液中含有Rep基因，重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞，符合預(yù)期結(jié)果（圖4）。

圖4　病毒液DNA PCR檢測電泳圖Fig．4 PCR electropherogram of virus liquid’s DNA

2．4 重組質(zhì)粒的免疫熒光試驗試驗

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞后，經(jīng)過72 h的培養(yǎng)進行免疫熒光試驗，通過熒光顯微鏡觀察，根據(jù)熒光的強弱判斷免疫熒光的結(jié)果，陽性細(xì)胞孔內(nèi)可觀察到典型的特異性亮綠色熒光，而陰性對照的細(xì)胞孔內(nèi)無特異性綠色熒光。設(shè)定PCV病毒液感染的PK15細(xì)胞孔為陽性對照，單純PK15細(xì)胞孔為陰性對照。由觀察可見，在C1-Rep重組質(zhì)粒和陽性對照中發(fā)現(xiàn)綠色熒光，陰性對照沒有（圖5）。

1：陽性對照；2：C1-Rep重組質(zhì)粒；3：陰性對照圖5　重組質(zhì)粒的免疫熒光試驗（100×）Fig．5 Immunofluorescence assay of recombinant plasmid（100×）

3 討論

一般認(rèn)為，PCV2-OPF2編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，即Cap蛋白，是PCV2的主要免疫保護性抗原，對PCV2疫苗的研究有重要的意義，研究較多，本實驗室亦成功構(gòu)建了Cap基因的原核表達載體并表達［9］，驗證了Cap蛋白的反應(yīng)原性。而對Rep蛋白的生物學(xué)特性報道不多。Rep蛋白作為PCV2病毒的復(fù)制酶蛋白，主要參與病毒的復(fù)制。而PCV2只有在動物體內(nèi)增殖時才可刺激機體產(chǎn)生抗Rep蛋白抗體［10］，在PK15細(xì)胞中Rep蛋白可以同時存在于細(xì)胞漿和細(xì)胞核中，隨著表達量的高低分布稍有變化，但不表現(xiàn)出對某一方面的親嗜性［11］。有報道說明Rep基因上含有一個優(yōu)勢免疫反應(yīng)區(qū)［12］，有一定的免疫原性。

間接免疫熒光試驗作為實驗室檢測PCV2的方法之一，宜用于檢測細(xì)胞培養(yǎng)物中的PCV2［13］。本研究通過間接免疫熒光試驗檢測PCV2 Rep蛋白在PK15細(xì)胞中的表達情況，說明構(gòu)建的真核PCV2 Rep基因在PK15上可以表達，初步確定了Rep蛋白的免疫原性，為接下來的研究提供了檢測依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。因為沒有一個定量指標(biāo)，本實驗無法準(zhǔn)確的測定蛋白表達的多少，有待于下一步研究。

參 考 文 獻

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（責(zé)任編輯：程智強）

Construction andimmunogenicity analysis of eukaryotic expression vector of porcine circovirus type 2 Rep gene

WANG Jing1，2，LIU Cheng-qian2，LI Hong2，YI Jian-zhong2*，YU Zong-xing1，2，CHEN Lei1，2，SUN Xiao-yun1，2
（1College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2Animal Husbandry and Veterinary Research Institute，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106，China）

Abstract：A pair of specific primers was designed and synthesized according to the porcine circovirus type 2（PCV2）gene sequence published in the GenBank，the PCV2 Rep gene was amplified by PCR from mutant strains of PCV2，and after cleaning and double digests the amplified products were connected to the pEGFP-C1 vector and transformed into E．coli DH5α competent cells" The correct recombinant gene was identified by PCR screening and sequencing，indicating the construction of eukaryotic expression vector was finished" The recombinant plasmid was transfected into PK15 cells，and then the virus liquid was collected to extract the DNA" The Rep gene detected by PCR proved that the transfection was successful" The experimental results well verified the immunogenicity of Rep gene in PK15 cells，thus laying a solid foundation for further study of the biological activities and new vaccine of PCV2"

Key words：Porcine circovirus type 2；Rep gene；Eukaryotic expression vector；Indirect immunofluorescence

*通信作者，E-mail：yijianzhong＠yahoo" com

作者簡介：王靜（1989—），女，碩士，主要從事動物疾病的分子生物學(xué)及免疫學(xué)研究。E-mail：jing1248＠126" om

基金項目：上海市科學(xué)技術(shù)委員會重點科技攻關(guān)項目（12391901900）

收稿日期：2015-02-03

文章編號：1000-3924（2016）01-006-04

中圖分類號：S852" 65

文獻標(biāo)識碼：A