陳 磊，劉成倩，李 紅，易建中*，王 靜，孫曉云

（1上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海201106）

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pET-32a載體介導(dǎo)的生長抑制素基因在大腸桿菌中表達

陳 磊1，2，劉成倩2，李 紅2，易建中2*，王 靜1，2，孫曉云1，2

（1上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海201106）

摘 要：為構(gòu)建pET-32a-2SS28-SS14和pET-32a-3SS28原核表達質(zhì)粒并檢測其在大腸桿菌中的表達，將兩種形式的生長抑制素SS14和SS28基因克隆到pET-32a載體中；酶切及測序鑒定后，采用不同終濃度的IPTG在37℃條件下進行誘導(dǎo)表達。Western blot結(jié)果顯示：兩組分別誘導(dǎo)出分子量大小為28" 4 kD和29" 8 kD的目的蛋白，不同終濃度的IPTG誘導(dǎo)對目的蛋白的表達量沒有明顯影響。目的蛋白主要為可溶性蛋白，少數(shù)以包涵體形式存在。本研究為生長抑制素基因工程疫苗生產(chǎn)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：生長抑素；表達質(zhì)粒；蛋白質(zhì)印跡

生長素抑制激素是一種多肽類激素，主要由下丘腦分泌釋放，放射免疫測定結(jié)果表明，其主要分布于心臟、甲狀腺、中樞及末梢神經(jīng)、消化系統(tǒng)中。生長抑制激素在體內(nèi)有著廣泛的抑制作用，例如：它通過抑制生長激素、胰高血糖素、胰島素、促甲狀腺激素等而抑制機體生長。研究證明，通過注射生長激素，可以增加動物的生長速度和飼料轉(zhuǎn)化效率。因此，理論上我們可以通過免疫中和動物體內(nèi)的生長抑制素，從而達到促進動物生長的目的。

有學(xué)者研究表明，通過人工合成的方法偶聯(lián)生長抑制素和異種的動物蛋白，用其免疫不同動物，能有效的促進動物生長［1-9］。但是人工合成生長抑制素成本限制其在生產(chǎn)實踐中的推廣應(yīng)用。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，利用蛋白表達系統(tǒng)獲得生長抑制素蛋白，在生長抑制素從應(yīng)用到生產(chǎn)實踐具有較高的可操作性。

生長抑制激素存在形式較多，例如：SS14、SS28和SS25等，一般認為它們的分子結(jié)構(gòu)和生物效應(yīng)均相似，并且在哺乳動物體內(nèi)其氨基酸序列也相同。鑒于表達的蛋白將用于免疫動物，本實驗選取用免疫原性和生物活性較好的SS28和SS14，將其克隆到pET-32a質(zhì)粒上，通過大腸桿菌融合表達系統(tǒng)對生長抑制素大腸桿菌基因進行表達。由于生長抑制素分子量?。? 658 D），本研究將生長抑制素基因進行重復(fù)串聯(lián)以提高其表達量以及增強目的蛋白免疫原性，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自Promega公司；DH5a、BL21（De3）菌株、IPTG、DNA膠回收試劑盒均購自北京全式金公司；pET-32a表達系統(tǒng)購自Novagen公司；小鼠抗his-tag一抗和山羊抗小鼠二抗購自世紀康維公司。

1．2 方法

1" 2" 1 生長抑制素基因的合成

根據(jù)生長抑制素基因設(shè)計BB-SS28、EH-SS28、XX-SS28、XX-SS14四個帶有不同酶切位點的SS28和SS14［10］基因單鏈。序列由上海捷瑞生物有限公司合成。

BB-SS28：

1" GATCCGGTGGTAGCGCTAACTCTAACCCGGCCATGGCACCGCG

2" TGAACGCAAAGCTGGCTGCAAGAATTTCTTCTGGAAGACCTTCACATCTTGTGGCGGCG

3" GATCCGCCGCCACAAGATGTGAAGGTCTTCCAGAAGAAATTCT

4" TGCAGCCAGCTTTGCGTTCACGCGGTGCCATGGCCGGGTTAGAGTTAGCGCTACCACCG EH-SS28：

1" AATTC GGTGGTAGCGCTAACTCTAACCCGGCCATGGCACCGCG

2" TGAACGCAAAGCTGGCTGCAAGAATTTCTTCTGGAAGACCTTCACATCTTGTGGCGGCG

3" AGCTT GCCGCCACAAGATGTGAAGGTCTTCCAGAAGAAATTCT

4" TGCAGCCAGCTTTGCGTTCACGCGGTGCCATGGCCGGGTTAGAGTTAGCGCTACCACCG XX-SS28：

1" TCGAG GGTGGTAGCGCTAACTCTAACCCGGCCATGGCACCGCG

2" TGAACGCAAAGCTGGCTGCAAGAATTTCTTCTGGAAGACCTTCACATCTTGTGGCGGCG

3" TCGAG GCCGCC ACAAGATGTGAAGGTCTTCCAGAAGAAATTCT

4" TGCAGCCAGCTTTGCGTTCACGCGGTGCCATGGCCGGGTTAGAGTTAGCGCTACCACCG XX-SS14：

1" TCGAGGGTGGTGCTGGCTGCAAGAATTTCTTCTGGAAGACCTTCACATCTTGTGGCC

2" TCGAGGCCACAAGATGTGAAGGTCTTCCAGAAGAAATTCTTGCAGCCAGCACCACCC

將合成好的單鏈基因按照要求加水稀釋成50 μmol/L，每條單鏈取4 μL再加同樣體積的Annealing Buff混合均勻，沸水浴2 min后自然冷卻至室溫。

1" 2" 2 pET-32a-2SS28-SS14表達質(zhì)粒的構(gòu)建

利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建質(zhì)粒［11］，提取pET-32a空載質(zhì)粒。取3 μL質(zhì)粒用BamHⅠ單酶切后，PCR清潔試劑盒清潔回收，再與BB-SS28用T4連接酶16℃鏈接16 h。將鏈接產(chǎn)物（pET-32a-SS28）轉(zhuǎn)化到E．coli DH5α，37℃培養(yǎng)過夜。送鉑尚生物技術(shù)有限公司進行測序鑒定。

將測序正確的菌株命名為pET-32a-SS28，并抽提質(zhì)粒，取3 μL該質(zhì)粒用EcoRⅠ和HindⅢ酶切后，用PCR清潔試劑盒清潔回收，再與EH-SS28用T4連接酶16℃鏈接16 h。將鏈接產(chǎn)物pET-32a-2SS28轉(zhuǎn)化到E．coli DH5α，37℃培養(yǎng)過夜。將測序正確的菌株命名為pET-32a-2SS28，并抽提質(zhì)粒，取3 μL該質(zhì)粒用XhoⅠ單酶切后，用PCR清潔試劑盒清潔回收，再與XX-SS14用T4連接酶16℃鏈接16 h。將鏈接產(chǎn)物pET-32a-2SS28-SS14轉(zhuǎn)化到E．coli DH5α，37℃培養(yǎng)過夜。測序正確后－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1" 2" 3 pET-32a-2SS28-SS14的目的基因誘導(dǎo)表達

取測序正確的菌種保藏液，在氨芐固體選擇培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)12 h，再選取單個菌落在液體LB培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)16 h后抽提pET-32a-2SS28-SS14質(zhì)粒，并同時與pET-32a空載質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到E．coli BL21 De3，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單個菌落液體氨芐LB培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h后，轉(zhuǎn)接到200 mL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃，190轉(zhuǎn)培養(yǎng)90 min左右，測定OD值，當(dāng)OD值在0" 5—0" 7時，試驗組加入IPTG，使終濃度分別為0 mmol/L、0" 05 mmol/L、0" 1 mmol/L、0" 2 mmol/L、0" 4 mmol/L、0" 8 mmol/L、1" 2 mmol/L，pET-32a空載質(zhì)粒組取0" 4 mmol/L IPTG 2 mL加入到培養(yǎng)基中，然后繼續(xù)37℃，190轉(zhuǎn)培養(yǎng)6 h。取1 mL菌液處理后進行15％SDS-PAGE電泳，然后通過考馬斯亮藍染色，脫色后進行灰度掃描。將培養(yǎng)基5 000 r/min 4℃離心10 min后，去上清，加入30 mL超聲波液溶解，用超聲波破碎儀破碎至液體清亮，8 000 r/min，4℃離心10 min，收集上清，用30 mL超聲波液溶解沉淀。取30 μL上清和沉淀經(jīng)處理后，進行15％SDS-PAGE電泳［12］，然后通過考馬斯亮藍染色，脫色后進行灰度掃描。

1" 2" 4 pET-32a-3SS28表達質(zhì)粒的構(gòu)建

抽提pET-32a-2SS28質(zhì)粒，取3 μL該質(zhì)粒用XhoⅠ單酶切后，用PCR清潔試劑盒清潔回收，再與XXSS28用T4連接酶16℃鏈接16 h。再將鏈接產(chǎn)物pET-32a-3SS28轉(zhuǎn)化到E．coli DH5α，37℃培養(yǎng)過夜。測序正確后菌種保藏。

1" 2" 5 pET-32a-3SS28的目的基因誘導(dǎo)表達

步驟同1" 2" 3

1" 2" 6 帶his-tag標(biāo)簽的2SS28-SS14和3SS28目的蛋白的Western blot檢驗

將pET-32a-2SS28-SS14和pET-32a-3SS28菌液破碎后的離心上清進行15％SDS-PAGE電泳，再通過轉(zhuǎn)印儀進行轉(zhuǎn)膜，60 mA，1 h，將蛋白膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后用脫脂奶粉封閉后用抗his-tag標(biāo)簽的小鼠一抗孵育，再用山羊抗小鼠的二抗孵育，通過ECL方法壓片曝光顯影。

2 結(jié)果與分析

2．1 2SS28-SS14和3SS28目的蛋白在pET-32a表達系統(tǒng)中的表達

2SS28-SS14和3SS28目的蛋白在不同濃度IPTG誘導(dǎo)表達，圖1和圖2中的電泳條帶經(jīng)灰度掃描后可知，2SS28-SS14和3SS28目的蛋白在終濃度IPTG分別為0 mmol/L、0" 05 mmol/L、0" 1 mmol/L、0" 2 mmol/L、0" 4 mmol/L、0" 8 mmol/L、1" 2 mmol/L誘導(dǎo)5 h的表達量無明顯差異。

圖1　pET-32a-2SS28-SS14目的蛋白（約28 418 D）在不同IPTG濃度誘導(dǎo)下的表達結(jié)果Fig．1 Expression of pET-32a-2SS28-SS14 protein （approximately 28 418 D）at different IPTG concentrations

圖2　pET-32a-3SS28目的蛋白（約29 887 D）在不同IPTG濃度誘導(dǎo)下的表達結(jié)果Fig．2 Expression of pET-32a-3SS28 protein （approximately 29 887 D）at different IPTG concentrations

2SS28-SS14和3SS28目的蛋白的水溶性，菌體破碎離心后，進行SDS-PAGE電泳，條帶灰度掃描后顯示（圖3），在37℃表達目的蛋白主要以水溶性存在只有少量為不溶性。

M：Marker；1—2：pET-32a-2SS28-SS14上清、沉淀；3—4：pET-32a-3SS28上清、沉淀圖3　pET-32a-2SS28-SS14和pET-32a-3SS28目的蛋白的水溶性Fig．3 Water solubility of expressed pET-32a-2SS28-SS14 and pET-32a-3SS28

2．2 帶有his-tag標(biāo)簽的2SS28-SS14和3SS28目的蛋白的Western blot檢驗

通過Western blot檢測驗證帶有his-tag標(biāo)簽的2SS28-SS14和3SS28目的蛋白（圖4）。

M：蛋白質(zhì)印跡Marker；1：pET-32a-3SS28蛋白質(zhì)印跡；2：pET-32a-2SS28-SS14蛋白質(zhì)印跡圖4　pET-32a-2SS28-SS14和pET-32a-3SS28蛋白質(zhì)印跡Fig．4 Western blots of pET-32a-2SS28-SS14 and pET-32a-3SS28

3 結(jié)論與討論

本試驗通過基因克隆技術(shù)，將生長抑制素中生物活性較高、免疫原性較好的兩種形式SS14、SS28基因克隆到pET-32a表達系統(tǒng)中，再通過IPTG誘導(dǎo)表達生長抑制素蛋白。通過此方法獲得的生長抑制素疫苗，可以解決人工合成生長抑制素成本太高的問題，為生長抑制素用于免疫經(jīng)濟動物促進生長和增強免疫［13-16］提供重要基礎(chǔ)。

在誘導(dǎo)蛋白時，一般IPTG的終濃度的合理調(diào)整可能會對誘導(dǎo)結(jié)果有一定的影響，但是本試驗中，在對IPTG終濃度在0" 05—1" 2 mmol/L范圍內(nèi)調(diào)整后誘導(dǎo)結(jié)果無明顯差異，該試驗結(jié)果提示，用不同終濃度IPTG對于在pET-32a表達系統(tǒng)中誘導(dǎo)表達2SS28-SS14和3SS28目的蛋白影響不明顯。由于IPTG價格較高，且有一定的毒性，所以在應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)時選用低濃度的IPTG即可達到生產(chǎn)目的，而且更有利于控制產(chǎn)品成本和質(zhì)量。

本試驗中，2SS28-SS14和3SS28目的蛋白在pET-32a表達系統(tǒng)37℃中誘導(dǎo)表達結(jié)果顯示，蛋白既有水溶性蛋白也有不溶性，其中水溶性蛋白比例更高，說明pET-32a表達系統(tǒng)對2SS28-SS14和3SS28目的蛋白有較好的表達效果。本研究為生長抑制素基因工程疫苗的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

參 考 文 獻

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（責(zé)任編輯：程智強）

Expression of pET-32a vector-mediated somatostatin gene in E．coil

CHEN Lei1，2，LIU Cheng-qian2，LI Hong2，YI Jian-zhong2*，WANG Jing1，2，SUN Xiao-yun1，2
（1College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2Animal Husbandry and Veterinary Research Institute，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106，China）

Abstract：In order to construct pET-32a-2SS28-SS14 and pET-32a-3SS28 prokaryotic expression plasmids and detect their expression in E．coil，both SS14 and SS28 somatostatin genes were cloned into pET-32a vector；and after enzyme digestion and sequencing，the inducible expression of target proteins was conducted at 37℃by using different final concentrations of IPTG" The Western blot showed that the induction at different final concentrations of IPTG had an insignificant effect on the expression of target proteins，and the induced expression molecular weights of both somatostatin genes were 28" 4 kD and 29" 8 kD respectively" The products were mainly a soluble protein and less inclusion body" The research laid the basis for production and application of somatostatin engineering vaccine"

Key words：Somatostatin；Expression plasmid；Western bolt

*通信作者，E-mail：yijianzhong＠yahoo" com

作者簡介：陳磊（1987—），男，碩士，主要從事亞單位疫苗研究。Tel：021-62204612，E-mail：64052087＠163" com

收稿日期：2015-04-07

文章編號：1000-3924（2016）01-015-04

中圖分類號：Q78

文獻標(biāo)識碼：A