紀(jì)永生郭文豪

（1.生物梅里埃（上海）生物制品有限公司 上海 201315；2.上海交通大學(xué) 上海 200240）

側(cè)向?qū)游雒庖咴\斷試劑信號(hào)放大的方法

紀(jì)永生1，2郭文豪1，2

（1.生物梅里埃（上海）生物制品有限公司 上海 201315；2.上海交通大學(xué) 上海 200240）

傳統(tǒng)的側(cè)向?qū)游雒庖咴\斷試劑（LFI， lateral flow immunoassay）具有快速、便宜、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。但是檢測(cè)靈敏度相對(duì)于ELISA，免疫熒光，化學(xué)發(fā)光等檢測(cè)試劑較低。為提高傳統(tǒng)LFI的檢測(cè)靈敏度，研究者開發(fā)了多種方法。本文討論了常用的幾種方法，并且對(duì)各自的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了闡述。

側(cè)向?qū)游?免疫診斷 信號(hào)放大

側(cè)向?qū)游雒庖咴\斷（Lateral flow immunoassay）是出現(xiàn)于20世紀(jì)80 年代初期的一種將免疫技術(shù)和色譜層析技術(shù)相結(jié)合的基礎(chǔ)上建立的一種簡(jiǎn)單、快速的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)［1］。它是將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在硝酸纖維素膜（NC 膜）上，把標(biāo)記過(guò)的另一抗原或抗體吸附在標(biāo)記物墊上，當(dāng)待測(cè)樣品加到試紙條一端的樣品墊上后，通過(guò)毛細(xì)作用向前移動(dòng)，溶解標(biāo)記物墊上的已經(jīng)標(biāo)記過(guò)的抗原或抗體后相互反應(yīng)，再移動(dòng)至固定了抗原或抗體的區(qū)域時(shí)，待測(cè)物和標(biāo)記物反應(yīng)后的復(fù)合物與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集在檢測(cè)帶上，通過(guò)可目測(cè)的顯色標(biāo)記物得到直觀的結(jié)果由于該技術(shù)操作簡(jiǎn)便［2］，快捷，試劑成本低。操作人員不需要接受特別的培訓(xùn)。因此，近30年來(lái)，它被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷，工業(yè)分析，食品安全以及環(huán)境檢測(cè)等各個(gè)方面［3］。但是跟傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑，熒光標(biāo)記免疫檢測(cè)試劑，放射標(biāo)記免疫檢測(cè)試劑等等相比，靈敏度顯得相對(duì)低，為了拓寬側(cè)向?qū)游雒庖咴\斷試劑的應(yīng)用范圍，各種放大信號(hào)，提高靈敏度的方法也被應(yīng)用到側(cè)向?qū)游雒庖咴\斷的平臺(tái)上。本文就一些放大信號(hào)的方法做一下討論。

1 高靈敏標(biāo)記物法

在側(cè)向?qū)游雒庖咴\斷試劑中最常用的顯色標(biāo)記物是納米膠體金顆粒和納米彩色乳膠微球。采用的納米膠體金顆粒一般在10nm到60nm，而采用的納米彩色乳膠微球一般在200nm到400nm。膠體金顆粒表面積小，蛋白吸附的少，但是顏色深。乳膠顆粒表面積大，蛋白吸附的多，但是顏色淺。兩者在實(shí)際應(yīng)用中，體現(xiàn)的靈敏度比較接近。為了尋求更高的靈敏度，其他各類標(biāo)記物也被應(yīng)用到了側(cè)向?qū)游雒庖咴\斷的平臺(tái)上。

1.1 量子點(diǎn)quantum dots

量子點(diǎn)（q u a n t u md o t s），又稱半導(dǎo)體納米微晶粒（semiconductor nanocrystal），通常是由ⅡB和ⅥA族元素組成，目前研究較多的主要是CdX（X=S、Se、Te）。通常量子點(diǎn)的研究粒徑范圍為2～20nm，在受到光激發(fā)或電壓后能產(chǎn)生熒光發(fā)射［4］。量子點(diǎn)也可以標(biāo)記各種分子到它們的表面，因此它也被應(yīng)用到了側(cè)向免疫層析免疫診斷試劑中，作為顯色標(biāo)記物，取代膠體金顆?；蛘呷槟z顆粒。但是需要配備紫外燈去激發(fā)量子點(diǎn)的熒光，同時(shí)要熒光讀數(shù)儀判讀結(jié)果，或者用數(shù)碼相機(jī)拍攝顯示熒光的照片。如果需要肉眼判讀結(jié)果，需要佩戴橙色過(guò)濾眼睛。相比于膠體金，熒光量子點(diǎn)可以提高靈敏度10到300倍。但是提高靈敏度的同時(shí)，也丟失了LFIA一部分簡(jiǎn)便的特性，它需要額外的儀器去做判讀。

1.2 磁珠Magnetic Nanoparticle

磁珠是指有磁性的Fe3O4顆粒。體積可以從nm級(jí)到um級(jí)。與膠體金顆粒相比，磁珠沒(méi)有鮮明的顏色，呈深褐色。除了肉眼可辨外，它也可以通過(guò)磁信號(hào)檢測(cè)進(jìn)行追蹤。同時(shí)，用磁珠作為標(biāo)記物制成的檢測(cè)試劑，信號(hào)可以長(zhǎng)時(shí)間保存，在首次檢測(cè)以后可以再回顧復(fù)測(cè)。相比于常規(guī)的膠體金檢測(cè)試劑，用磁信號(hào)檢測(cè)時(shí)，靈敏度能提高40倍［5］。缺點(diǎn)是與量子點(diǎn)標(biāo)記一樣，需要額外的儀器幫助判讀。

1.3 上轉(zhuǎn)換磷光材料標(biāo)記UCP

上轉(zhuǎn)換磷光材料（UCP）是一種可以對(duì)能量進(jìn)行尚轉(zhuǎn)換的稀土金屬合成物。它在紅外光激發(fā)下，能夠發(fā)射波長(zhǎng)短于激發(fā)光的可見光。用UCP材料作為標(biāo)記物，可以大幅提高檢測(cè)的靈敏。同時(shí)由于不同的UCP材料具有不同的特征光譜， 可以一次性對(duì)生物樣品的多種目標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。而獨(dú)特的上轉(zhuǎn)換發(fā)光現(xiàn)象，使它跟其他的熒光材料相比，消除了待檢樣品自發(fā)熒光的干擾，提高了信噪比。同其他的熒光標(biāo)記物一樣，UCP也需要熒光讀數(shù)儀來(lái)判讀。

1.4 酶標(biāo)記Enzyme

采用ELISA的方法，將標(biāo)記物墊上的蛋白標(biāo)記上酶，如HRP ，試劑條的其他結(jié)構(gòu)不變。在第一步加入樣品層析完成以后，再加入底物，通過(guò)顯色反應(yīng)得到不同強(qiáng)度的條帶。相較于普通的側(cè)向?qū)游?，測(cè)試的步驟增加了，需要添加底物，以及清洗。整體的測(cè)試時(shí)間也會(huì)延長(zhǎng)。如果催化產(chǎn)生的是熒光，那么同樣還需要熒光讀數(shù)儀進(jìn)行判讀。雖然信號(hào)放大了，但是需要耗費(fèi)的成本也增加了。

1.5 同時(shí)采用金顆粒標(biāo)記和酶標(biāo)記

（1）將HRP酶標(biāo)記到金顆粒上［6］。（2）將HRP酶標(biāo)記到抗體或抗原上，然后把抗體或抗原再標(biāo)記到金顆粒上。HRP催化底物（3，30，5，50-Tetramethylbenzidine （TMB）； 3-Amino-9-ethylcarbazole（AEC）； 3，30-Diaminobenzidine tetrahydrochloride （DAB））反應(yīng)顯色。同時(shí)金顆粒的存在也會(huì)加強(qiáng)酶催化底物的顯色反應(yīng)。這個(gè)三個(gè)底物產(chǎn)生的顯色物是非可溶性的，因此不會(huì)發(fā)生層析，從而留在本來(lái)已經(jīng)產(chǎn)生的色帶的位置，從而加強(qiáng)了信號(hào)。同單酶標(biāo)記一樣，操作時(shí)需加入，清洗，加底物，清洗等環(huán)節(jié)，因此操作步驟增加，測(cè)試時(shí)間延長(zhǎng)。

1.6 銀染法

由于操作簡(jiǎn)單，靈敏度高等特點(diǎn)。銀離子在納米金顆粒外部成核的現(xiàn)象已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于定性和定量的生物感應(yīng)器的信號(hào)放大。側(cè)向?qū)游雒庖咴\斷試劑也可以用銀染法獲得更高的靈敏度。當(dāng)然，它是建立在金顆粒標(biāo)記的基礎(chǔ)上的。在第一步層析免疫反應(yīng)已經(jīng)完畢后，金顆粒已經(jīng)在測(cè)試線聚集。在試劑條測(cè)試線的位置加入硝酸銀溶液和氫醌溶液或者將試劑條浸入溶液中，使已在抗原位置沉積的金顆粒發(fā)揮催化作用，促進(jìn)銀離子被氫醌還原為銀原子，后者圍繞金顆粒形成一層黑色的銀殼，而大幅度增強(qiáng)色帶的深度。放大的效果是在10倍以上［7］?？墒亲鳛榭焖僭\斷試劑，在側(cè)向?qū)游雒庖叻磻?yīng)完成以后，額外還要進(jìn)行銀染，同樣還是增加了操作步驟。為了達(dá)到平常的側(cè)向?qū)游雒庖咴\斷試劑的操作簡(jiǎn)易程度。

1.7 紅外信號(hào)檢測(cè)法

金屬納米顆粒在光照下產(chǎn)熱。通過(guò)這個(gè)原理，運(yùn)用普通的LED光源和紅外線接收槍也可以大幅提高普通金標(biāo)記的側(cè)向?qū)游雒庖咴\斷試劑的靈敏度。提高幅度達(dá)32倍，甚至有潛力到1000倍。采用這種方法，無(wú)需對(duì)傳統(tǒng)的金標(biāo)記側(cè)向?qū)游雒庖咴\斷試劑做改變。無(wú)需更換標(biāo)記物。只需要建立參考值或標(biāo)準(zhǔn)曲線。需要更多考慮的是如何才能產(chǎn)生穩(wěn)定的熱信號(hào)，將CV控制的盡量低。

1.8 聚合金顆粒法

聚酰胺-胺型樹枝狀高分子（PAMAM），像樹枝一樣，具有很多分叉，水溶性，是具有多功能性的大分子?？梢远ㄖ凭_的大小和形狀，以及表面的基團(tuán)。得益于外圍的功能性樹枝狀基團(tuán)，很多位點(diǎn)可以用來(lái)連接各種分子，以及納米顆粒，比如量子點(diǎn)。納米金顆粒通過(guò)電荷作用同樣也可以連接到PAMAM的表面。單個(gè)納米金顆粒由于體積小，能包被的抗體或抗原比較少，通過(guò)PAMAM的作用，可以將多個(gè)納米金顆粒組成納米金團(tuán)，增大單個(gè)金團(tuán)的表面積，增加抗體抗原的包被量，從而提高靈敏度。聚合金顆粒法相比傳統(tǒng)的單金顆粒側(cè)向?qū)游雒庖咴\斷試劑，依然可以用肉眼判讀。主要改變的就是增加了聚合單個(gè)納米金顆粒成為納米金團(tuán)的步驟，隨后標(biāo)記抗原抗體，以及制作其他組分的過(guò)程都一樣，而靈敏度可以提高20倍。所以在側(cè)向?qū)游雒庖咴\斷試劑開發(fā)的過(guò)程中有較大的應(yīng)用潛力。所需要特別注意的是，嚴(yán)格控制PAMAM的量，以及聚集時(shí)間，避免過(guò)多的納米金顆粒聚集從而沉淀。

1.9 雙層金標(biāo)墊法

傳統(tǒng)金標(biāo)記側(cè)向?qū)游雒庖咴\斷試劑在樣品墊和膜之間有一層標(biāo)記墊。雙層金標(biāo)墊法就是在傳統(tǒng)的試劑結(jié)構(gòu)上再加一層金標(biāo)墊。這上面包被的金顆粒，用于捕獲另一層金標(biāo)墊的傷的金顆粒。第一層的金顆粒了標(biāo)記了捕獲目標(biāo)抗原的抗體，同時(shí)用BSA進(jìn)行封閉。所以最后金顆粒連著的是抗體以及BSA。第二層的金顆粒包被抗-BSA抗體，再選用另一個(gè)封閉劑封閉（人血白蛋白，PEG等）。在反應(yīng)過(guò)程中，第一層的金顆粒上的抗體抓住抗原，再被另一個(gè)包被在膜上的抗體截留在測(cè)試線。第二層的金顆粒在層析的過(guò)程中，被第一層的金顆粒攔截。從而使更多的納米金顆粒在測(cè)試線位置聚集放大測(cè)試信號(hào)。雙層金標(biāo)墊方法可以使靈敏度提高40到1000倍［8］。

2 改變?cè)噭l結(jié)構(gòu)

在銀染法中已經(jīng)提到過(guò)，研究者結(jié)合銀染法，運(yùn)用雙向?qū)游鼋Y(jié)構(gòu)，使得銀染操作也在一步完成，以便獲得高靈敏度的同時(shí)，保留操作的簡(jiǎn)易性。這一節(jié)講的是，傳統(tǒng)試劑條結(jié)構(gòu)的變化對(duì)信號(hào)放大的作用。研究者通過(guò)增加金標(biāo)墊和樣品墊的尺寸，保留測(cè)試線原有的寬度，提高了標(biāo)記物的使用了，而且延長(zhǎng)了層析反應(yīng)的時(shí)間，最后獲得靈敏的提高，信號(hào)放大了約8倍。試劑條整體改動(dòng)的不大，但是對(duì)于生產(chǎn)卻增加了不少難度。并且由于增加了樣品墊的尺寸，對(duì)樣品的加入量也有了更大的需求。

2.1 改變操作過(guò)程

為了獲得高靈敏度，有研究者采取了濃縮樣品中目標(biāo)蛋白的方法，獲得更高濃度的目標(biāo)蛋白復(fù)合物的濃度，再加入到試劑條上，進(jìn)行測(cè)試。靈敏度也能提高10倍。濃縮的方法是借用Triton X114能與水在4度混溶，而在37度能形成水相和去污劑相的原理，以及生物分子的疏水性和分子量大小等特性會(huì)讓它們?cè)谒嗪腿ノ巯嘈纬刹煌植紳舛鹊奶匦詫?shí)現(xiàn)的［24］。研究也嘗試了將金顆粒與樣本混合反應(yīng)后再進(jìn)行濃縮，同意也是可行的。雖然兩者在不同的檢測(cè)項(xiàng)目上都顯現(xiàn)出了10倍的信號(hào)放大，但是混合金顆粒和樣本，加長(zhǎng)了樣本與金顆粒的反應(yīng)時(shí)間，所以有著更高放大倍數(shù)的可能性。相對(duì)于傳統(tǒng)操作方法，多了預(yù)加樣，并且需要不同溫度的孵育，對(duì)于POC的應(yīng)用提出較高的條件，但是對(duì)于靈敏度的提高，效果還是比較直觀的。

2.2 應(yīng)用Streptavidin-biotin系統(tǒng)

Streptavidin和biotin是一對(duì)具有高親和力的物質(zhì)，至少比抗原-抗體結(jié)合力高百萬(wàn)倍， 是目前發(fā)現(xiàn)的自然界中具有最強(qiáng)親和力的物質(zhì)［9］。在雙層金標(biāo)墊法中，Streptavidin-biotin被用來(lái)作為兩個(gè)金顆粒之間的連接系統(tǒng)。除了這個(gè)應(yīng)用外，它也被直接應(yīng)用于傳統(tǒng)的側(cè)向?qū)游雒庖咴\斷試劑，用于信號(hào)放大。

3 總結(jié)

LFI已經(jīng)在醫(yī)學(xué)，工業(yè)，研究多個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，通過(guò)各種信號(hào)放大的方法，LFI檢測(cè)靈敏度得到進(jìn)一步提高，應(yīng)用范圍也將更將寬廣。在將來(lái)，信號(hào)放大的方法也將進(jìn)一步融合，使得信號(hào)得到層級(jí)放大，最后接近甚至達(dá)到各類大型自動(dòng)化免疫儀器所具有的靈敏水平。

［1］祖立闖，王金良，李嬌，沈志強(qiáng).膠體金免疫層析技術(shù)在動(dòng)物疫病診斷上的應(yīng)用［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010（8）：101-105

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