周鳴鳴++王順+++汪亞玲+++蔡洪玉+++李德全+++談蓉+++趙德兵+++俞晨+++豆長明+++張潔

摘要：提取了鹽堿脅迫處理的玉米YQ7-96品系3葉1心期的葉莖混合組織總RNA，運用SMART技術構建pDNR-LIB載體的cDNA文庫，并隨機挑選克隆進行EST序列的BlastX比對和MIPS歸類分析。結果發(fā)現(xiàn)，在隨機挑取的2個4 000個cDNA克隆測序中，95.0%的EST符合分析要求（長度大于150 bp，非rRNA），共獲得3 217條擁有BlastX注釋信息的EST序列，鹽堿脅迫的EST數(shù)據(jù)庫歸類的比例信息比較接近。其中維持正常生理活動占比分別為50.63%（鹽脅迫）和52.79%（堿脅迫），參與細胞內(nèi)運輸、細胞內(nèi)信號傳導、細胞防御和細胞循環(huán)和DNA代謝過程的基因分別為22.05%（鹽脅迫）、19.03%（堿脅迫），參與能量代謝和轉(zhuǎn)錄相關的基因分別為15.77%（鹽脅迫）、15.36%（堿脅迫）。本研究構建的鹽堿脅迫下玉米cDNA文庫及相關基因表達分析結果，為后續(xù)研究提供了基礎數(shù)據(jù)。

關鍵詞：玉米；鹽脅迫；堿脅迫；EST；生理功能

中圖分類號： S513.03文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）02-0060-02

收稿日期：2015-03-25

基金項目：江蘇省高校自然科學研究面上項目（編號：12KJB310009）；農(nóng)業(yè)部南方平原玉米科學觀測站開放課題基金（編號：NT201409）；江蘇省博士后科研資助計劃（編號：1201023B）；南通大學校級課題（編號：2012002）；南通大學博士啟動基金（編號：03080519、03080227）。

作者簡介：周鳴鳴（1977—），男，江蘇南通人，博士，副教授，主要從事植物分子遺傳學研究。E-mail：13912293932@163.com。

通信作者：張潔，博士，副教授，主要從事分子遺傳學研究。E-mail：zmm7711@163.com。

玉米（Zea mays L.）既是重要的糧食和飼料作物，又是重要的工業(yè)原料。目前我國是玉米生產(chǎn)第二大國，僅次于美國，但隨著玉米深加工等新興玉米工業(yè)的興起，市場上玉米供求的矛盾日益加劇，提高玉米的綜合生產(chǎn)力已經(jīng)成為一項緊迫的任務。玉米是對鹽堿中度敏感的作物，只能在0.3% NaCl以下的土壤上生長，這極大地限制了玉米在鹽堿灘地上的生長[1]。據(jù)統(tǒng)計，目前世界上有100多個國家存在不同類型的鹽堿地，面積達1億hm2，約占全球耕地面積的10%；其中我國有 0.26 億 hm2的鹽堿地[2]。在鹽堿地種植玉米會導致嚴重減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)，通過土壤改良等手段解決鹽堿地問題進展緩慢，迫切需要提高品種耐鹽堿程度。但玉米耐鹽堿種質(zhì)缺乏，采用常規(guī)育種方式選育高耐鹽堿玉米新品種十分困難。

鹽堿土是在特定自然環(huán)境和人為活動因素綜合影響下，鹽類直接參與土壤形成過程，并以鹽（堿）化過程為主導而形成的，具有鹽化層或堿化層，其中含有大量可溶鹽類，從而抑制植物正常生長的土壤。鹽堿土包括鹽土、堿土兩大類型。鹽和堿脅迫同屬水分滲透脅迫，其主要的生理變化機制是一致的[3]。本研究分析了在正常和鹽、堿共脅迫下生長的玉米品系YQ7-96在3葉1心期（苗期20 cm左右）的EST數(shù)據(jù)庫，并對其EST進行了初步分析，旨在找出玉米主栽高產(chǎn)品種分子育種基因標記探針。

1材料和方法

1.1材料

玉米品系YQ7-96。

1.2方法

1.2.1玉米處理和收集玉米種子催芽后待根長2～3 cm時，點種于營養(yǎng)盤中，Hoagland 營養(yǎng)液培養(yǎng)，置于網(wǎng)室。處理組在3葉1心期，每盆澆5 L的含100 mmol/L混合鹽（50 mmol/L NaCl，50 mmol/L Na2SO4） 的Hoagland液作為鹽脅迫處理組和25 mmol/L NaHCO3及 25 mmol/L Na2CO3 的Hoagland液（pH值11，水勢為-0.7 MPa） 作為堿共脅迫處理。處理7 d后，分別采集玉米的莖葉混合組織，立即用液氮冷凍后保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2mRNA的純化參照文獻[4]提取RNA。采用FastTrack2.0 Kit （Invitrogen） 試劑盒，并按其操作說明從總RNA中提取mRNA。

1.2.3EST文庫構建用CreatorTM SMART cDNA Library Construction Kit（ CLONTEECH） 試劑盒并按操作說明進行。

1.2.3EST文庫克隆片段長度篩選PCR 引物1（5′-AACAGCTATGACCATG-3′）；引物2（5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3′），反應條件：96 ℃變性10 min，94 ℃ 35 s，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30 個循環(huán)，72 ℃ 10 min[4]。

1.2.4[JP3]EST序列分析與注釋同源性比較參數(shù)的得分（score）與匹配堿基數(shù)和同源性相關EST的組裝分析按照文獻[4]方法進行，用http：//www.ncbinlm.nih.gov/blastX/和MIPS網(wǎng)站提供的各種生物信息學在線分析工具對EST進行在線比對。

2結果與分析

2.1EST數(shù)據(jù)分析

對鹽和堿脅迫2個CDNA文庫各2 000個克隆進行了的5′端測序。經(jīng)過校正，4 000條序列中符合要求的（測序中N的比例<5%，外源長度>150 bp，且是非線粒體，非rRNA序列）共有3 802條EST序列，占總測序數(shù)量的 95.0%。符合要求的EST序列從文本格式轉(zhuǎn)換為通用的FASTA格式。再利用vector_screen軟件掃描去除有效序列載體上的序列，同時屏蔽序列上所有的Poly（A）?！扒鍧崱焙蟮男蛄羞M行序列組裝分析，3 802條EST中有注釋信息的共有3 217條（84.6%），無注釋信息的共有585條（15.4%）（表1）。

2.2BlastX注釋

2個EST數(shù)據(jù)庫中，已有注釋信息的 3 217 條EST序列共產(chǎn)生2 167條被MIPS系統(tǒng)歸類的信息（表2），其中參與新陳代謝、蛋白質(zhì)合成加工和亞細胞水平定位的基因所占比例最高，分別達到50.63%（鹽脅迫）和 52.79%（堿脅迫），這3類基因表達的蛋白為維持正常生理活動所必需；細胞內(nèi)運輸、細胞內(nèi)信號傳導、細胞防御、細胞循環(huán)和DNA代謝過程的基因所占比例也較高，分別為 22.05%（鹽脅迫）、19.03%（堿脅迫）。這部分基因的高豐度表達可能與玉米抗逆反應有關，同時也表明植物抗逆反應涉及到復雜的信號轉(zhuǎn)導；參與能量代謝和轉(zhuǎn)錄相關的基因比例分別為 15.77%（鹽脅迫）、15.36%（堿脅迫）。參與細胞發(fā)育、細胞分化和細胞構成組分相關的基因含量相對最低，2個EST數(shù)據(jù)庫各項均不超過2.1%；1.36%（鹽脅迫）和1.05%（堿脅迫）的雖有同源的蛋白，但是無法歸于以上的各類。另外，鹽和堿脅迫的EST數(shù)據(jù)庫除了在蛋白合成和蛋白質(zhì)加工（折疊、修飾和定位）2項上占比差異較大，總體上被MIPS系統(tǒng)歸類的比例信息是比較接近的。

3討論

植物應對鹽堿脅迫是一個非常復雜的過程，包括阻止新陳代謝過程、光合速率降低、生長緩慢或停滯，提高或激發(fā)脅迫誘導基因的表達、氧化酶活性的提高、ABA含量迅速增高、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他保護性物質(zhì)的積累、抑制能量消耗途徑等[5]。在長期的進化過程中，植物能夠在適應一種逆境的同時提高對其他逆境脅迫的抵抗力，此即植物的交叉適應（cross-adaption）[6]。植物對逆境的交叉適應具有普遍性，已有研究表明，植物對逆境的適應可能存在共同的機制，鹽和堿脅迫同屬水分滲透脅迫，其主要的生理變化機制是與干旱脅迫存在相似的機理[7]，但抗脅迫的代謝途徑和相關基因也不盡相同[8]。玉米表達基因EST研究中，MGDP曾經(jīng)組織了24個單位和實驗室，構建了不同玉米品種、株系器官組織的24個不同的EST文庫，這些EST文庫大致可分為以下幾類：正常生長組織、鹽脅迫、突變株和病菌侵染組織的EST文庫，測序分析發(fā)現(xiàn)了大量新的表達基因（http：//www.zmdb.iastate.edu/zmdb/EST/libraries.html）。

如同其他植物一樣，玉米可能遭受的逆境多種多樣，且常常是多因子的綜合作用，其中干旱和鹽堿是影響玉米產(chǎn)量和品質(zhì)最大的非生物逆境脅迫因子。玉米在苗期的耐鹽堿性很重要，因為植株苗期的生長情況影響其最終的產(chǎn)量。本試驗是在借鑒前人耐鹽堿性鑒定方法的基礎上對玉米耐鹽堿性鑒定的方法進行研究。在玉米對鹽堿脅迫最敏感的3葉1心期進行鹽堿脅迫處理7 d。因此，本研究構建的是對鹽堿敏感的生長關鍵時期3葉1心期混合組織的表達基因的EST數(shù)據(jù)庫，測序分析部分EST的信息表明該文庫中包含有大量（所分析EST中的52.00%）未知功能基因的EST。由于該文庫是鹽和堿脅迫處理下的玉米混合組織的表達基因EST文庫，包括了在玉米耐受鹽堿關鍵的生長時期，在鹽和堿脅迫生長條件下的所有特異表達基因，將會對公共數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)存的玉米EST數(shù)據(jù)起到補充作用。

在本試驗過程中，玉米鹽堿處理濃度是獲得相關基因表達的重要因素，因此耐鹽堿性濃度的確定是構建耐鹽堿性CDNA文庫的關鍵。目前，國內(nèi)外對玉米耐鹽堿性鑒定還沒有形成統(tǒng)一的、權威的耐鹽堿鑒定濃度，大部分的研究者是根據(jù)自身的鑒定方法、處理溶液選取不同的鑒定濃度，而且在操作[CM（25]過程中的誤差或人為因素都有可能造成鑒定濃度的不同。[CM）]

所以，本試驗中對耐鹽堿性鑒定濃度的篩選是很必要的。本研究最終確定的玉米苗期鹽性處理濃度為100 mmol/L，確定的玉米苗期堿處理濃度為35 mmol/L；劉芳等研究表明 250 mmol/L NaCl是玉米苗期耐鹽性篩選的理想濃度[9]，崔美燕的研究表明 25 mmol/L Na2CO3可以作為玉米苗期耐堿性鑒定的理想濃度[10]。本試驗中使用的耐鹽堿脅迫濃度與其他人的研究存在一定差異，并使用較重的脅迫參數(shù)，這樣更有利于獲得相關的EST表達。此外，研究人員曾采用苗情評價的方法對玉米自交系幼苗進行耐鹽堿性鑒定，根據(jù)鹽或堿脅迫處理7 d后苗情觀察來評價玉米材料的耐鹽堿性狀，非常直觀、簡單[10-11]。本試驗中也是收集7 d的玉米混合組織作為抽提RNA的材料。

本研究提取處理玉米品系YQ7-96的3葉1心期的莖葉混合組織的總RNA，運用SMART技術構建pDNR-LIB載體的cDNA文庫，在成功構建了鹽和堿脅迫的玉米cDNA文庫的基礎上，對產(chǎn)生的EST進行了測序和分析歸類，篩選出細胞功能相關EST，為后續(xù)研究提供了基礎數(shù)據(jù)。

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