潘遠健++金剛++謝振華++代建國+++王妍++欒崇林++于化泓

摘要：利用高鹽結(jié)合SDS裂解法，對杜氏鹽藻、湛江叉鞭金藻、球等鞭金藻葉綠體及其DNA進行分離和提取。經(jīng)超聲波勻漿后差速離心，可獲得比較完整的葉綠體，再經(jīng)有機試劑萃取，可得到產(chǎn)率較高、純度較好的葉綠體DNA，經(jīng)PCR擴增得到清晰的條帶。本試驗方法快速簡便，DNA質(zhì)量可以滿足后續(xù)分子生物學(xué)操作需要。

關(guān)鍵詞：微藻；葉綠體；葉綠體DNA；提取方法

中圖分類號： Q244；S917文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0066-03

收稿日期：2015-01-15

基金項目：廣東省深圳市科技項目（編號：JC201005280534A、JCY20130331151022276）；廣東省自然科學(xué)基金（編號：10151805501000007）。

作者簡介：潘遠健 （1987—），男，廣西梧州人，碩士研究生，從事基因調(diào)控研究。E-mail：wenrenzhiying@163.com。

通信作者：金剛，博士，教授，主要從事水生生物學(xué)研究。E-mail：jingang@szpt.edu.cn。葉綠體是綠色植物進行光合作用的細胞器。20世紀初，學(xué)者根據(jù)植物葉片的花斑現(xiàn)象具有母性遺傳的特性，推斷在葉綠體上或許存在核外的遺傳因子。20世紀60 年代初，隨著電鏡技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，葉綠體基因組的存在由Gupta等證實[1]。目前，葉綠體DNA（cpDNA）被廣泛應(yīng)用于細胞質(zhì)遺傳、植物系統(tǒng)發(fā)育、植物雄性不育、親緣關(guān)系、葉綠體轉(zhuǎn)基因等研究中。微藻作為水體生態(tài)系統(tǒng)重要的初級生產(chǎn)者及潛在的外源基因表達載體，研究其葉綠體和cpDNA功能、結(jié)構(gòu)特征，對于葉綠體表達體系構(gòu)建具有重要作用。因此，快速、簡便地獲得質(zhì)純、量大cpDNA是許多工作的前提。目前，獲得微藻完整葉綠體和純度高、濃度大的微藻cpDNA存在一定困難，主要原因是微藻種類繁多，每種微藻有其生物學(xué)特點，缺乏通用方法；葉綠體DNA含量較少，在提取過程中存在諸多干擾因素 （核DNA、RNA、蛋白質(zhì)等）。

提取植物cpDNA的傳統(tǒng)方法有CsCl2梯度離心及DNaseⅠ結(jié)合蔗糖梯度離心等，這些方法操作較繁瑣，不易同時獲得理想的產(chǎn)率、純度。20世紀80年代至今，在非藻類植物葉綠體提取、微藻葉綠體分離技術(shù)等方面研究成果較多[2-9]。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上作了一些改進（如離心時間和速度、藻體破碎方法、葉綠體破碎時間、DNA分離時的離心速度和時間等），提取杜氏鹽藻（Dunaliella salina）、湛江叉鞭金藻（Dicrateria Zhanjiangensis）、球等鞭金藻（Isochrysis galbana）的完整葉綠體，結(jié)果較為滿意。

1材料與方法

1.1材料

杜氏鹽藻、湛江叉鞭金藻、球等鞭金藻由筆者所在實驗室培養(yǎng)。

1.2試劑配制[7]

緩沖液A：400 mmol/L蔗糖、50 mmol/L Tris-HCl（pH值 8.0）、20 mmol/L EDTA-Na2、0.2% BSA、0.2%巰基乙醇（現(xiàn)用現(xiàn)加）；緩沖液B：400 mmol/L蔗糖、50 mmol/L Tris-HCl （pH值 8.0）、0.1% BSA；緩沖液C：1.25 mol/L NaCl、50 mmol/L EDTA、50 mmol/L Tris-HCl（pH值 8.0）；緩沖液D：100 mmol/L Tris-HCl（pH值 7.8）、50 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl、0.2%巰基乙醇（現(xiàn)用現(xiàn)加）。試驗所用試劑蛋白酶K、DNase Ⅰ、DNA Maker等購于寶生物工程（大連）有限公司。

1.3分離葉綠體和提取cpDNA[9]

把生長到對數(shù)期的微藻置于0～4 ℃暗處理24 h。將暗處理后的500 mL藻液分裝到50 mL離心管中，4 ℃下 5 500 r/min 離心2 min收集藻細胞（沉淀），棄上清。往以上所得沉淀加入30 mL緩沖液A，冰上破碎1.5 min得藻體破碎液。將藻體破碎液用6層濾網(wǎng)（300目）過濾，濾液倒入離心管中，4 ℃ 1 000 r/min離心20 min，收集上清。將上清液在4 ℃ 4 000 r/min離心20 min，棄上清，將沉淀保存于4 ℃冰箱備用。DNA酶去核處理：往上一步所得沉淀中加入200 μL 緩沖液B、2.5 μL DNase-Ⅰ、40 μL 0.2 mol/L MgCl2，37 ℃靜置15 min。加入200 μL 0.4 mol/L EDTA-Na2，再加入緩沖液C，4 ℃ 4 000 r/min離心20 min，棄上清。在上一步所得沉淀中加入600 μL 預(yù)冷的緩沖液D，30 μL 20% SDS（終濃度1%），2.5 μL 蛋白酶K（始濃度為1 mg/mL），60 ℃水浴2 h。冷卻后加入等體積的酚 ∶氯仿 ∶異戊醇（25 ∶24 ∶1）混合液，4 ℃ 10 000～12 000 r/min離心10 min，取上清。上清液加入等體積的氯仿：異戊醇= 24 ∶1，4 ℃ 10 000～12 000 r/min離心10 min，取上清。上清加入1/5體積的3 mol/L NaAc及2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，-80 ℃放置1 h，然后4 ℃下12 000 r/min離心10 min，棄上清。加入預(yù)冷的75% 乙醇，10 000 r/min離心10 min洗滌1～2次（此步驟要特別小心，重懸DNA時動作要輕緩。操作太劇烈會機械斷裂cpDNA）。倒立EP管，自然晾干或置于超凈臺風(fēng)干。加入30～40 μL 1×TE，-20 ℃保存。

1.4蔗糖密度梯度法分離球等邊金藻、杜氏鹽藻葉綠體DNA

參考曲京東的蔗糖梯度離心法[9]分離球等邊金藻、杜氏鹽藻葉綠體DNA，其中2個蔗糖梯度分別為40%、60%。采用紫外分光光度法檢測cpDNA的濃度、純度。

1.5葉綠體rps2基因、rbcL基因片段的擴增

為了驗證所提取的cpDNA質(zhì)量，參照NCBI上收錄的杜氏鹽藻rps2基因、球等鞭金藻rbcL基因序列設(shè)置2對引物：rps1：5′-AGCAAGACGAATACGAGT-3′，rps2：5′-TTTACGACAATTATACCG-3′；rbcL1：5′-AAGCCTCTAATGCAACAC-3′，rbcL2： 5′-CCACAAACTGAAACGAAA-3′。分別以所提取的杜氏鹽藻、球等鞭金藻的cpDNA為模板，進行PCR擴增。反應(yīng)體系如表1所示。

同時設(shè)置1個陰性對照，驗證提取的cpDNA有無基因組DNA污染。利用鹽藻基因組DNA的特異引物對：前：5′ -TGAGCCTGTGCGTGTTTC- 3′；后：5′ -GGTGTCTTGCGTGAGTG -3′，并以所提取的cpDNA、基因組DNA作為模板（表2）。

2結(jié)果與分析

2.1葉綠體顯微觀察

在葉綠體提取的不同階段進行顯微觀察，以確定不同階段葉綠體形態(tài)的變化。圖1-a是光學(xué)顯微鏡下完整的杜氏鹽藻細胞，其形態(tài)呈梭形或球形，隨其運動的改變而改變，細胞的一端幾乎完全被葉綠體占據(jù)。圖1-b是經(jīng)過超聲波破碎和差速離心后分離得到的杜氏鹽藻完整葉綠體，在葉綠體周圍可以看到光暈，說明所得葉綠體比較完整，外膜沒有被破壞。圖1-c為蔗糖密度梯度離心所得葉綠體。圖2-a為湛江叉鞭金藻完整細胞，圖2-b是湛江叉鞭金藻完整的葉綠體。圖3-a為球等鞭金藻完整細胞，圖3-b、圖3-c分別是球等鞭金藻完整葉綠體。

2.2cpDNA的電泳檢測

將2種方法提取的3個不同海水藻提到的cpDNA進行0.7%瓊脂糖凝膠電泳（110 V/mL，40 min，8 μL ），得到整齊干凈的條帶，如圖4所示。M為maker；1、3、4分別為差速離

心所提取的杜氏鹽藻cpDNA、球等鞭金藻cpDNA、湛江叉鞭金藻cpDNA；2、5分別為蔗糖梯度離心所得杜氏鹽藻cpDNA、球等鞭金藻cpDNA。

2.3分光光度計檢測cpDNA的濃度和純度

表3為快速分離法所得cpDNA純度、濃度，表4為蔗糖密度梯度離心法所得cpDNA光密度結(jié)果。由表3可知，快速差速離心抽提到的cpDNA濃度約2.80 μg/mL，D260 nm/D280 nm接近1.8，說明其含量及純度都較為理想，可用于后續(xù)分子操作。由表4可知，蔗糖密度梯度離心法提取的cpDNA濃度約1.00 μg/mL，D260 nm/D280 nm約1.6，這可能跟含有色素雜質(zhì)等有關(guān)。

2.4葉綠體rps2基因、rbcL基因片段的擴增

rps2、rbcL基因基因都在目的片段長度處顯示出整齊干凈的條帶（圖5），第3泳道沒有明顯的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。3結(jié)論與討論

開始分離葉綠體之前，把藻液在黑暗下低溫靜置24 h，可以降低葉綠體中淀粉的含量，減少淀粉核對葉綠體膜的破壞性，有利于分離得到完整的葉綠體[9]。經(jīng)差速離心以后分離到的葉綠體樣品純度雖然相對很高，但是仍有來自細胞核的污染。因此，本試驗在保持葉綠體不破碎的前提下（低溫下完整葉綠體比較穩(wěn)定），在葉綠體樣品中加入DNase Ⅰ并于37 ℃靜置15 min以去除來自核DNA的潛在污染。在裂解葉綠體時先充分重懸，再加入SDS，可提高葉綠體破碎效果，提高cpDNA得率。本研究結(jié)果表明，蔗糖梯度密度分離的葉綠體及其cpDNA濃度都比較低，此外，還存在著2個不同濃度的蔗糖緩沖液混合時間過長就會相溶在一起，提取的葉綠體層面比較窄，葉綠體得率低的弊端。PTOX1基因在以cpDNA為模板時沒有明顯的條帶，說明所得DNA純度比較高。

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