張瑤++蒙麗君++官菊芳++晉曉勇

摘要：通過抗原抗體的特異性識(shí)別作用以及生物條形碼的信號(hào)放大作用，構(gòu)建了一種新的電化學(xué)免疫傳感器，用以檢測(cè)人免疫球蛋白（hIgG）。將抗體Ab1修飾到金電極上，加入抗原（hIgG），經(jīng)過抗原抗體的免疫反應(yīng)再將已制備好的納米金標(biāo)記抗體Ab2和生物條形碼（Ab2-AuNPs-B）修飾到該免疫傳感器上，通過觀察電化學(xué)阻抗的變化來監(jiān)控免疫傳感器的構(gòu)建過程。利用生物條形碼的信號(hào)放大作用，通過循環(huán)伏安法和差示脈沖伏安法對(duì)hIgG的含量進(jìn)行定量檢測(cè)，其檢出限達(dá)到0.4×10-5 mg/L。

關(guān)鍵詞：生物條形碼；信號(hào)放大技術(shù)；生物傳感器；hIgG；納米金

中圖分類號(hào)： Q511文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）02-0308-04

收稿日期：2015-02-26

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：21067010、21365016）。

作者簡(jiǎn)介：張瑤（1989—），女，碩士研究生，主要從事生化分析及生物傳感器的研究。E-mail：zdjcyylx@163.com。

通信作者：晉曉勇，博士，副教授，主要從事生化分析及生物傳感器的研究。Email：xiaoyongjin @126.com。蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，它對(duì)人體的健康有著極其重要的作用[1-4]。人免疫球蛋白G（hIgG）是血清中含量最高的一種免疫蛋白，是機(jī)體再次免疫應(yīng)答后形成抗體的主要組分，在機(jī)體防御機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用，在臨床上作為多種疾病診斷及療效評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)[5-7]，因此對(duì)其進(jìn)行定性、定量檢測(cè)顯得尤為重要。傳統(tǒng)的免疫分析法檢測(cè)hIgG由于存在操作步驟較為繁瑣、儀器設(shè)備昂貴等缺點(diǎn)，因此在實(shí)際應(yīng)用中受到了一定的限制，難以較大范圍推廣。

傳統(tǒng)檢測(cè)hIgG的方法主要有質(zhì)譜法[8]、熒光分析法[9-10]、電化學(xué)分析法[11-13]等。其中，電化學(xué)方法由于具有較高的靈敏度、極低的檢測(cè)限逐漸受到廣泛關(guān)注。生物條形碼因其較高的選擇性和生物特異性也日益受到人們廣泛重視[14-15]。早期的生物條形碼主要用于DNA的檢測(cè)[16-17]，而在蛋白質(zhì)分子的檢測(cè)及應(yīng)用方面還鮮有報(bào)道。綜合以上背景，本研究將電化學(xué)方法與生物條形碼相結(jié)合，以hIgG為模型蛋白，對(duì)其進(jìn)行定量定性分析。

1材料與方法

1.1儀器和材料

電化學(xué)工作站（EC550，湖北武漢高仕睿聯(lián)科技有限公司），UV-265紫外儀（日本島津），三電極體系：金盤電極（直徑2.0 mm），飽和甘汞電極（SCE），Pt電極，KQ-2200B超聲清洗器（江蘇昆山超聲儀器廠）。

本試驗(yàn)所用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）均為：Na2HPO4（天津市化學(xué)試劑六廠）和NaH2PO4（山東萊陽市雙雙化工有限公司）的混合溶液，Na2CO3（陜西西安化學(xué)試劑廠），氯金酸、疊氮化鈉（阿拉丁試劑公司）等均為分析純，試驗(yàn)用水均為超純水。

兔抗人IgG抗體（Ab1）、hIgG、羊抗人IgG抗體（Ab2）購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。條形碼序列B：5′-SH-TAGTAAGTAA-FC-3′ 合成于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2納米金（AuNPs）的制備

將100 mL 的氯金酸（0.01%）加入到250 mL的圓底燒瓶中加熱，攪拌至沸騰后向其中加入4.0 mL的檸檬酸三鈉（1%），繼續(xù)加熱10 min [18]，制成的納米金于4 ℃下保存，用于制備金標(biāo)抗體。

1.3AuNPs與Ab2及條形碼序列（B）的結(jié)合（Ab2-AuNPs-B）

試驗(yàn)原理如圖1-a所示，具體試驗(yàn)步驟如下：用Na2CO3調(diào)節(jié)納米金pH值至9.0，加入100 μL Ab2（250 mg/L）振蕩混勻，室溫靜置3 h，除去上清液中游離抗體，將離心后聚合物分散于0.05 mol/L含有0.05%疊氮化鈉的PBS（pH值7.0）中。后將100 μL B（10 μmol/L）加入已制備好的Ab2-AuNPs中振蕩均勻，室溫靜置1 h。離心，除去上清液中未結(jié)合的B。將已制備好的Ab2-AuNPs-B分離到0.05 mol/L含有 0.05% 疊氮化鈉的PBS（pH值7.0）中，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4電極修飾及免疫傳感器的構(gòu)建

將金電極（直徑2.0 mm）用0.3 μm的Al2O3粉末打磨洗凈，再用0.05 μm的Al2O3粉末將金電極打磨至光滑鏡面。超純水分2次超聲清洗5 min，并將金電極浸入新制的Piranha溶液[98% H2SO4 ∶H2O2（體積比）=7 ∶3]約15 min。依次用超純水、95%乙醇超聲約3 min。將電極置于0.5 mol/L H2SO4 溶液中，在0～1.5 V電位范圍內(nèi)掃循環(huán)伏安曲線直至峰形穩(wěn)定。最后依次用超純水、95%乙醇、丙酮超聲3 min，氮?dú)獯蹈杀砻妫鳛楣ぷ麟姌O備用。滴加10 μL Ab1修飾于金電極表面，一定時(shí)間后，用PBS（pH值7.0）緩沖液沖洗數(shù)次，再滴加BSA（1%）溶液封閉電極30 min，用PBS（pH值7.0）沖洗。

1.5目標(biāo)物的分析檢測(cè)

滴加10 μL hIgG，使之與電極上修飾的Ab1特異性結(jié)合，一定時(shí)間后，用PBS（0.01 mol/L，pH值7.0）緩沖液沖洗數(shù)次，除去未結(jié)合的hIgG，再滴加10 μL Ab2-AuNPs-B。采用三電極體系，以玻碳電極為工作電極，Pt電極為對(duì)電極，飽和甘汞電極為參比電極，采用循環(huán)伏安法和差示脈沖伏安法對(duì)hIgG進(jìn)行檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1試驗(yàn)原理

基于生物條形碼及納米金信號(hào)放大的電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)hIgG的構(gòu)建過程如圖1所示。首先將Ab1固定于金電極表面，加入hIgG及Ab2-AuNPs-B，經(jīng)過抗原抗體的免疫反應(yīng)，構(gòu)建免疫傳感器。通過納米金及生物條形碼將檢測(cè)信號(hào)放大。最后通過電化學(xué)差示脈沖伏安法對(duì)條形碼上標(biāo)記的二茂鐵進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的定量檢測(cè)。

2.2表征B-AuNPs-Ab2

B-AuNPs-Ab2形成以后，AuNPs所處化學(xué)環(huán)境發(fā)生改變。結(jié)合基團(tuán)的紫外吸收光譜中的波長(zhǎng)及吸光度會(huì)發(fā)生變化。因此，本研究采用紫外-可見光譜法來監(jiān)控 B-AuNPs-Ab2的形成。

B-AuNPs-Ab2的合成方法如“2.3”節(jié)所述，通過紫外可見吸收光譜對(duì)其組成及化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征。如圖2所示，AuNPs和B-AuNPs-Ab2的最大吸收波長(zhǎng)分別在525 nm和533 nm處。B-AuNPs-Ab2的吸收峰相比AuNPs吸收峰發(fā)生紅移，主要原因可能是AuNPs上結(jié)合了Ab2及B使顆粒尺寸變大，顆粒周圍的微環(huán)境發(fā)生改變。在270 nm處，B-AuNPs-Ab2相對(duì)于AuNPs有較強(qiáng)的的吸收峰。說明，Ab2與B已經(jīng)成功修飾在納米金上（圖2）。

2.2電極表面不同狀態(tài)的阻抗表征

法拉第阻抗圖譜是一種測(cè)量電極界面性質(zhì)的有效方法，能用于表征免疫傳感器的組裝過程，阻抗圖譜包括高頻的半圓部分（相當(dāng)于動(dòng)力學(xué)控制的過程）和低頻的直線部分（相當(dāng)于擴(kuò)散控制的過程），每層的電子傳遞情況用電阻來表示，可通過計(jì)算半圓部分的半徑而得到，半圓的直徑越大所對(duì)應(yīng)電子傳遞的阻力越大，因此可以通過監(jiān)控半圓的直徑變化來監(jiān)控電極的修飾過程[19]。

由圖3可見，經(jīng)過修飾后的金電極（b、c、d）與裸金電極（a）相比，阻抗都有所增加。表明電子傳遞效率最高，裸金電極阻抗最小。當(dāng)加入Ab1后（b），阻抗增大。是由于Ab1的存在阻礙了氧化還原探針在電極上的電子傳遞，使得Ab1修飾的金電極的電阻與裸金電極的電阻相比有所增加。當(dāng)再加入hIgG后（d），由于抗體分子在電極表面形成了一層阻礙電子傳遞的屏障，使得電子傳遞的效率明顯降低，從而導(dǎo)致阻抗進(jìn)一步增大。當(dāng)繼續(xù)加入Ab2-AuNPs-B后（c），阻抗值要小于d曲線，這是由于B-AuNPs-Ab2上標(biāo)記了AuNPs，使電子傳遞效率增大，高頻區(qū)半徑減小，阻抗減小。

2.3試驗(yàn)條件的優(yōu)化

本試驗(yàn)考察了免疫分析的結(jié)合時(shí)間以及包被抗原的濃度。如圖4-A所示，較少體積的Ab1不能夠確保有足夠的抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，使得測(cè)定的信號(hào)值較低；相反，Ab1的用量為0.1 mg/L時(shí)，測(cè)定信號(hào)有顯著提高。此外，Ab1與hIgG的結(jié)合時(shí)間也是影響免疫傳感器信號(hào)的重要因素。如圖4-B 所示，當(dāng)Ab1結(jié)合到電極上的時(shí)間為45 min時(shí)，免疫傳感器的信號(hào)值最大。如圖4-C所示，電化學(xué)響應(yīng)隨著免疫時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，當(dāng)免疫時(shí)間為40 min時(shí)，免疫傳感器的電化學(xué)響應(yīng)達(dá)到最大值，當(dāng)繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間時(shí)，響應(yīng)并未有明顯增大。因此分別選擇45、40 min為最優(yōu)時(shí)間。

2.4目標(biāo)物分析檢測(cè)結(jié)果

本試驗(yàn)采用循環(huán)伏安法（CV）和差示常規(guī)脈沖伏安法（DNPV）優(yōu)化反應(yīng)條件，對(duì)hIgG進(jìn)行檢測(cè)（圖5）。圖5-A、圖5-B是不同修飾電極表面的循環(huán)伏安曲線和差示脈沖伏安曲線。由圖5可以看出，當(dāng)Ab2-AuNPs-B結(jié)合到hIgG上后，有1對(duì)二茂鐵的氧化還原峰出現(xiàn)，信號(hào)明顯增強(qiáng)，說明

納米金修飾的生物條形碼具有很好的信號(hào)放大作用。由于差示常規(guī)脈沖伏安法所檢測(cè)的電化學(xué)信號(hào)強(qiáng)于循環(huán)伏安法檢測(cè)的峰電流信號(hào)。因此選用差示常規(guī)脈沖伏安法對(duì)hIgG峰電流值進(jìn)行檢測(cè)，并作標(biāo)準(zhǔn)曲線。隨著hIgG濃度的減小，峰電流值隨之減小，在一段濃度范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系。檢測(cè)hIgG所得結(jié)果：回歸方程為I（μA）=2.77 lgCIgG+27.75，相關(guān)系數(shù)r=0.99，其線性范圍為0.003 2～ 31 μg/L，檢出限為0.004 μg/L，遠(yuǎn)低于基于碳納米管固定抗原的檢測(cè)方法[20]的檢測(cè)限2 μg/L與基于金納米棒標(biāo)記免疫分析方法[21] 的檢測(cè)限25 μg/L?？赡茉蚴牵菏紫?，由于納米金粒子具有粒徑小、比表面積大、表面反應(yīng)活性高、催化效率高等優(yōu)異性[22-23]，能有效結(jié)合一端修飾有巰基的條形碼；其次，每個(gè)納米粒子上都結(jié)合了成百上千個(gè)生物條形碼，采用DNPV法能夠有效地捕捉這些條形碼另一端標(biāo)記的二茂鐵的信號(hào)，使得電化學(xué)信號(hào)得以放大；最后，采用BSA封閉金電極，可有效降低傳感器的非特異吸附，避免了其他相關(guān)干擾。

2.5傳感器的特異性及重現(xiàn)性

特異性和重現(xiàn)性是考察傳感器的重要因素。本研究考察了免疫傳感器對(duì)干擾蛋白如癌胚抗原、肌紅蛋白（Mb）以及BSA的電化學(xué)響應(yīng)。結(jié)果表明，當(dāng)檢測(cè)物含有1.0 μg/L hIgG及2 μg/L BSA、肌紅蛋白、癌胚抗原時(shí)，電化學(xué)免疫分析方法測(cè)定的結(jié)果如圖6所示。由此可以看出此免疫傳感器具有良好的特異性。

將制備的免疫傳感器保存于4 ℃下，每隔5 d進(jìn)行測(cè)試。在 5 d 后，電流值僅減小了4.1%。20 d后電流響應(yīng)值為原來的89.8%。試驗(yàn)結(jié)果表明，此傳感器具有良好的穩(wěn)定性。于同一條件下，用5只金電極對(duì)同一濃度hIgG（1 ng/mL）做相關(guān)分析，檢測(cè)結(jié)果見表1，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為 6.4%。

3結(jié)論

本試驗(yàn)研究了高靈敏的電化學(xué)免疫傳感器。結(jié)合了電化學(xué)方法與生物條形碼技術(shù)，采用夾心型模式對(duì)hIgG進(jìn)行了檢測(cè) 。 此傳感器利用納米金比表面積和良好的導(dǎo)電性，條形碼放大信號(hào)的優(yōu)點(diǎn)，極大地提高了靈敏度 。此免疫傳感器檢出限低，穩(wěn)定性好，可望用于其他生化物質(zhì)的檢測(cè)。

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