齊慧杰 秦曉惠 劉凌云

（河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，開封 475004）

QI Hui-jie QIN Xiao-hui LIU Ling-yun

（State Key Laboratory of Cotton Biology，College of Life Science，Henan University，Kaifeng 475004）

植物Rab蛋白家族的研究進(jìn)展

齊慧杰 秦曉惠 劉凌云

（河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，開封 475004）

Rab家族是一類非常重要的小G蛋白，在多種細(xì)胞生理活動中都起著至關(guān)重要的作用。高等植物進(jìn)化出了一組獨(dú)特的Rab蛋白來滿足各種細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸?shù)奶囟ㄐ枰?。?xì)胞內(nèi)Rab蛋白感知上游信號通過自身活性的調(diào)節(jié)影響植物生長發(fā)育及對環(huán)境脅迫的反應(yīng)。對植物Rab蛋白進(jìn)化特點(diǎn)、結(jié)構(gòu)特征及各成員在植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)中的功能進(jìn)行了綜述。

Rab；結(jié)構(gòu)特征；發(fā)育；脅迫

Rab蛋白是一類分子量為20-30 kD的小G蛋白，該蛋白以單體形式參與真核細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、囊泡運(yùn)輸和骨架組裝等過程［1］。作為細(xì)胞內(nèi)的“分子開關(guān)”，Rab蛋白通過與GTP或GDP結(jié)合與否分別處于“開”或“關(guān)”的狀態(tài)。在胞內(nèi)激活信號存在時，膜結(jié)合的Rab蛋白被鳥苷酸交換因子（GEF）激活，使Rab從結(jié)合GDP的無活性形式轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)合GTP的活性形式，隨后活化的Rab通過其效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域與下游蛋白相互作用，從而啟動細(xì)胞相應(yīng)的生理過程。Rab蛋白有微弱的內(nèi)在GTP水解酶活性，因此它需要GAP（GTPase-activating protein）激活其GTP水解酶活性，加速GTP水解，促使Rab快速失活，細(xì)胞信號傳遞得以迅速終止［2］。本文就植物Rab蛋白進(jìn)化、結(jié)構(gòu)特征、上下游信號及在發(fā)育和脅迫響應(yīng)中的生理功能進(jìn)行詳細(xì)闡述。

1 植物Rab蛋白家族進(jìn)化特點(diǎn)

Rab是小G蛋白中成員最多的一個蛋白亞家族。已知擬南芥有57個Rabs，水稻有52個［3］，人類有60個，酵母則有11個［4］。作為雙子葉植物的代表，擬南芥Rab亞家族被劃分為A-H八個分支［3］，盡管擬南芥和哺乳動物中Rab成員總數(shù)相近，但哺乳動物60個Rab中的33個成員在擬南芥中沒有明確的同源基因，這些差異可能反映特定生物體囊泡運(yùn)輸活性的不同［4］。

植物不同基因組（擬南芥、玉米和水稻）中每個Rab亞家族的基因序列相對保守。其中Rab1和Rab8有8個外顯子，Rab2、Rab6和Rab18有6個外顯子，Rab5（除OsRab5D1）和Rab7成員各有7個外顯子，說明Rab同一亞家族基因起源于共同的祖先。然而，Rab11成員由外顯子數(shù)目從1到4高度分化的基因組成，表明Rab11成員有復(fù)雜的起源［3］。計算機(jī)模擬分析顯示，雙子葉植物和單子葉植物在Rab功能分化中存在著明顯分歧，說明Rab在這兩類植物中可能分別行使特定的細(xì)胞功能［3］。植物Rab蛋白具有與動物或真菌相似的保守序列，但植物Rab蛋白更多功能上的信息還需要進(jìn)一步去驗(yàn)證。與此相一致的是，不同生物體來源的Rabs表現(xiàn)出功能上的互補(bǔ)。例如，酵母Ypt1缺失或溫度敏感突變體的表型能夠被團(tuán)藻、萊茵衣藻、蕓苔屬甘藍(lán)型油菜和小鼠的小G蛋白所回補(bǔ)。酵母YPT6缺失突變體表型則可以被擬南芥Rab6回補(bǔ)［5］。植物RabF（Rab家族）和RabSF（Rab家族）具有序列保守性及跨物種功能互補(bǔ)性，這不僅表明Rab蛋白與其調(diào)節(jié)子和效應(yīng)器之間的互作在進(jìn)化過程中是保守的［4，6，7］，而且也暗示這些蛋白互作對于細(xì)胞囊泡運(yùn)輸過程非常重要。因此，從酵母和動物同源蛋白或通過與酵母突變體互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)推斷相應(yīng)Rab在植物中的生物學(xué)功能就成為一種常用的研究方法。

2 植物Rab蛋白的結(jié)構(gòu)特征

氨基酸序列分析顯示不同植物Rab蛋白具有30%-55%的序列同源性，同時還具有一些共同的結(jié)構(gòu)特征，其中包括4個保守的鳥嘌呤核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域［8］。具體特征如下：G1區(qū)（P-環(huán)，GDSGVGKT）參與Mg2+和GTP β-磷酸的識別與結(jié)合；G3區(qū)（“開關(guān)II”，WDTAGQ）中的DTAG與GTP γ-磷酸相互作用；G4區(qū)（GNKXD）的NKXD是GTP鳥嘌呤堿基的識別位點(diǎn)；G5區(qū)（ETSAK）的ETSA與G4區(qū)NKXD的D殘基相互作用。因此，G1和G3-G5區(qū)共同參與核苷酸結(jié)合和水解過程。G2區(qū)（“開關(guān)I”，YKATIGADF）為效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域，包含單個Rab的功能信息，其TIGADF基序與特定GTP酶激活蛋白（GAPs）相互作用［8］。此外，Rab的YRG基序也高度保守，但其功能尚不清楚。鳥嘌呤核苷酸的結(jié)合和水解造成G區(qū)“開關(guān)I”和“開關(guān)II”構(gòu)象的顯著變化。在Rab處于激活狀態(tài)時，“開關(guān)I”通過保守的蘇氨酸結(jié)合Mg2+和GTP γ-位磷酸，“開關(guān)II”不結(jié)合GDP，但其DTAGQ基序中的甘氨酸能夠與GTP γ-位磷酸相互作用［9，10］。

已知Ras小G蛋白“開關(guān)II”中谷氨酸殘基突變會引起GEF調(diào)節(jié)的GDP釋放趨緩，從而使Ras活性降低［11］。由于Ras亞家族和Rab序列的高度保守性［12，13］，人們推測Rab可能具有與Ras相似的活性調(diào)節(jié)機(jī)制。然而實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Rab“開關(guān)II”中保守的谷氨酸殘基突變?yōu)楸彼釙r對于GEF介導(dǎo)的核苷酸交換效率幾乎沒有影響［11］。除了Ras和Rab激活機(jī)制存在潛在的差異，GTP酶激活蛋白（GAP）介導(dǎo)的Rab失活機(jī)制在關(guān)鍵步驟上與Ras也有分歧。Ras中保守的“開關(guān)II”谷氨酰胺和精氨酸殘基作為Ras活性部位共同參與了GAP促進(jìn)的GTP水解過程，同時這些氨基酸殘基的突變也抑制了GTP的水解。Rab中盡管“開關(guān)II”谷氨酰胺同樣保守，但Rab33、Rab1分別與GAP蛋白TBC結(jié)構(gòu)域形成復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)顯示該谷氨酰胺在GTP水解時并未發(fā)揮直接作用，相反，GAP的精氨酸和谷氨酰胺殘基對Rab活性位點(diǎn)的催化起著關(guān)鍵作用［14，15］。因此，盡管Ras和Rab家族成員在關(guān)鍵的“開關(guān)”區(qū)域序列高度保守，但它們之間依然存在著不同的失活與激活機(jī)制。并且隨后實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)即使在Rab家族內(nèi)部不同Rab之間也存在著不同的激活機(jī)制［16］，這可能與特定Rab的蛋白結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)。

3 植物Rab蛋白的上下游信號研究

Rab蛋白一方面受上游GEF分子的激活；另一方面也受GAP蛋白的失活，通過這些上游信號分子的活性調(diào)節(jié)來響應(yīng)胞外信號，并把信號傳遞給下游成分，從而使細(xì)胞做出相應(yīng)生理反應(yīng)。VPS9a（vacuolar protein sorting 9A）作為一個植物Rab-GEF能夠激活所有Rab5成員，包括傳統(tǒng)類型的ARA7、RHA1以及植物特有的ARA6［17］。擬南芥功能缺失突變體vps9a對鹽高度敏感，VPS9a活性與鹽脅迫下植物重塑根細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)，形成細(xì)胞內(nèi)大液泡的過程密切相關(guān)［18］。水稻GLUP6（glutelin precursor mutant6）/GEF通過激活Rab5活性來調(diào)節(jié)胚乳中谷蛋白前體的積累［19］；作為植物Rab活性調(diào)節(jié)的另一個分子GAPs，僅有個別成員的功能被解析。擬南芥RabGAP22參與油菜素內(nèi)酯、茉莉酸和脫落酸介導(dǎo)的植物內(nèi)生免疫反應(yīng)［20］，煙草NbRabGAP1作為一個潛在的Rab GTP水解酶激活蛋白調(diào)節(jié)竹子花葉病毒（BaMV）的細(xì)胞內(nèi)遷移［21］，水稻OsGAP1通過調(diào)節(jié)OsRab11活性介導(dǎo)水稻幼苗對高鹽的適應(yīng)［22］。到目前為止，植物大多數(shù)成員的RabGAP活性還沒有分析，它們的Rab底物也沒有確定。同時，由于植物體內(nèi)Rab成員眾多，存在著復(fù)雜的功能冗余，其下游信號成分的解析，依然困難重重。

4 植物Rab家族成員的功能

在進(jìn)化過程中，不同生物Rab家族以差異化的成員擴(kuò)增模式來行使植物發(fā)育和生理功能的調(diào)節(jié)作用。然而，這些Rab的基本功能還沒有研究清楚。因此植物細(xì)胞中不同Rab在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的特定作用還需要詳細(xì)地分析。

4.1 Rab在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用

水稻一個Rab相關(guān)基因rgp1表現(xiàn)出年齡依賴性的表達(dá)，用DNA甲基化抑制劑5-氮胞苷處理幼苗后，該基因表達(dá)量減少［23］。用rgp1轉(zhuǎn)化煙草表現(xiàn)出明顯的表型變化，最引人注目的是頂端優(yōu)勢減少、分蘗增加、矮化及花結(jié)構(gòu)異常［23］，與對照相比，轉(zhuǎn)基因植物中內(nèi)源細(xì)胞分裂素水平增加了6倍，表現(xiàn)出其在激素信號傳導(dǎo)中的作用。

隨后從芒果中分離一個類似于Rab11的基因（MiRab11），該基因在成熟果實(shí)中差異表達(dá)，在未成熟果實(shí)則不存在差異表達(dá)［24］。同樣，番茄LeRab11a在果實(shí)成熟過程中表達(dá)量較高，在不成熟果實(shí)中表達(dá)量降低，表明該基因在果實(shí)成熟時可能被乙烯誘導(dǎo)表達(dá)。LeRab11a反義轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)顏色發(fā)生了改變但果實(shí)柔軟度降低，說明果實(shí)成熟誘導(dǎo)Rab11參與細(xì)胞壁修飾酶到質(zhì)外體運(yùn)輸?shù)氖聦?shí)。桃（P. persica L. Batsch）PpRABA1-1、PpRABA2、PpRABD2-1、PpRABD2-2和PpRABC2基因在果實(shí)成熟期表達(dá)上調(diào)，可能控制細(xì)胞壁成分和修飾酶的胞外運(yùn)輸［25］。

研究表明，豌豆PRA2在調(diào)控油菜素內(nèi)酯合成方面有特定作用［26］。擬南芥ARA2基因被生長素誘導(dǎo)，ARA2超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株由于改變了生長素響應(yīng)基因的表達(dá)從而對生長素敏感，表現(xiàn)出側(cè)根減少的表型。相應(yīng)ara2突變體在0.01 μmol/L IAA（吲哚乙酸）處理時表現(xiàn)出側(cè)根數(shù)目增加的表型；GFP-ARA2融合蛋白定位于內(nèi)涵體，表明ARA2在生長素極性運(yùn)輸?shù)鞍椎哪遗葸\(yùn)輸中發(fā)揮作用［27］。另外，水稻OsRab11超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株通過誘導(dǎo)JA（茉莉酸）響應(yīng)基因的表達(dá)表現(xiàn)出抗病表型。因此，OsRab11可能參與JA介導(dǎo)的防御反應(yīng)信號途徑［28］。

4.2 Rab在囊泡運(yùn)輸中的作用

Rab蛋白在結(jié)合GTP或GDP條件下通過構(gòu)象變化調(diào)節(jié)囊泡運(yùn)動。這些蛋白定位于不同細(xì)胞區(qū)室從而控制囊泡運(yùn)輸過程中的錨定和膜融合。分泌蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑通過高爾基復(fù)合體遷移到反面高爾基體，隨后被運(yùn)送至最終目的地。通過分析Rab參與植物細(xì)胞囊泡運(yùn)輸?shù)臋C(jī)制，了解重要細(xì)胞器的生物合成和維護(hù)。

一些研究已經(jīng)表明Rab在植物細(xì)胞運(yùn)輸中的作用。如Rab1參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體間的運(yùn)輸［29］；Rab5參與早期內(nèi)涵體的轉(zhuǎn)運(yùn)［30］；Rab8參與了質(zhì)膜的膜轉(zhuǎn)運(yùn)［31］。擬南芥原生質(zhì)體瞬時表達(dá)OsRab7-GFP融合蛋白顯示其定位在液泡內(nèi)，該結(jié)果強(qiáng)烈地暗示OsRab7運(yùn)輸囊泡到液泡參與液泡的生物合成［32］。另外，RabE1D參與反面高爾基體和質(zhì)膜之間的蛋白質(zhì)運(yùn)輸［31］。

4.3 Rab在植物生長發(fā)育中的作用

Rab在根毛和花粉管頂端生長中是肌動蛋白細(xì)胞骨架和囊泡運(yùn)輸?shù)闹匾M成部分。對于正在快速生長的植物根毛和花粉管細(xì)胞來說，囊泡運(yùn)輸?shù)慕⒑晚敹藰O性的維持都是極其重要的。已知RabA1d定位于早期內(nèi)涵體或者反面高爾基體參與囊泡運(yùn)輸，調(diào)節(jié)細(xì)胞板形成及根毛尖端生長［33］。RabA4d調(diào)控擬南芥花粉管的生長［34］。RabA2在菜豆根毛極性生長和根瘤發(fā)育中起到重要作用［5］。AtRabD2b和AtRabD2c也在擬南芥花粉發(fā)育和花粉管生長過程中發(fā)揮作用［35］。而NtRab2主要在煙草花粉中表達(dá)，但在下胚軸、子葉、真葉、發(fā)育中的根及成熟的雌蕊也可以檢測到。GFP-NtRab2融合蛋白定位于花粉管中的高爾基體，NtRab2在花粉發(fā)育中參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體之間的物質(zhì)運(yùn)輸［36］。擬南芥木質(zhì)部管胞分化期間伴隨著自我吞噬程序化死亡過程的發(fā)生，RabG3b作為自我吞噬過程的一個成分調(diào)節(jié)木質(zhì)部管胞分化［37］。

4.4 Rab在生物和非生物脅迫中的作用

植物內(nèi)膜系統(tǒng)不僅參與細(xì)胞壁、質(zhì)膜和液泡生物合成的調(diào)控，而且在生物和非生物脅迫反應(yīng)中也發(fā)揮著重要的作用。耐旱植物Sporobolus stapfianus的Rab2基因在水分虧缺時轉(zhuǎn)錄增加，甚至在干葉子中也保持高水平表達(dá)，這些結(jié)果暗示內(nèi)膜系統(tǒng)的激活可能是保護(hù)植物免受干旱傷害的原因［38］。水稻OsRab7B3 作為一個脅迫誘導(dǎo)基因在葉片衰老過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用［1］。冰葉日中花（M. crystallinum）Rab5家 族 的Mcrab5b在400 mmol/L NaCl處理時被誘導(dǎo)表達(dá)［39］。水稻OsRab7［32］、擬南芥AtRab7［40］、狼尾草PgRab7［41］、鹽生植物（Aeluropus lagopoides）AlRab7［42］在冷、脫水、鹽及ABA等脅迫處理時均被誘導(dǎo)表達(dá)。因此不同脅迫環(huán)境中Rab7的誘導(dǎo)表達(dá)表明該基因在參與適應(yīng)這些脅迫。擬南芥組成型激活的RABA1b（Q72L）蛋白定位在質(zhì)膜上，而GFP-RABA1b位于囊泡且沿著肌動蛋白微絲動態(tài)變化成簇排列。有意思的是，4個主要的擬南芥RABA1成員被一起敲除時，這些RABA1B顯性失活突變體表現(xiàn)出對鹽的超敏感反應(yīng)。而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示RABA1成員通過介導(dǎo)反式高爾基體與質(zhì)膜間的物質(zhì)運(yùn)輸來耐受高鹽脅迫［43］。超表達(dá)狼尾草PgRab7的轉(zhuǎn)基因煙草植株也表現(xiàn)出對干旱和鹽脅迫抗性的增強(qiáng)［41］。超表達(dá)水生植物木豆PjRab7增加植物對鹽的耐受性并且轉(zhuǎn)基因植物與對照比積累更多的Na+［44］。此外，轉(zhuǎn)基因擬南芥組成型表達(dá)AtRab7可以增加植物對鹽和滲透脅迫的耐受性，并且在鹽脅迫過程中活性氧積累減少；擬南芥超表達(dá)AtRab7轉(zhuǎn)基因植株顯示地上部鈉含量增加，轉(zhuǎn)基因植物中Na+在液泡積累［40］，從而保持低細(xì)胞質(zhì)毒性及增加植物對鹽脅迫的耐受性。Rab7調(diào)節(jié)鈉穩(wěn)態(tài)的機(jī)制還不是很清楚。在細(xì)胞質(zhì)中Na+水平可能被某些其他的機(jī)制調(diào)節(jié)，從而保持Na+/K+比率平衡，這在將來會是一個有趣的研究領(lǐng)域。

PRA2（豌豆的一個Rab）調(diào)節(jié)DDWF1（dark induced DWF-like protein 1）的蛋白活性［26］，煙草中DDWF1的同源基因被植物病原菌或真菌激活子［45］所誘導(dǎo)，顯示這些基因參與生物脅迫抗性的產(chǎn)生。研究表明，小麥TaRab7在小麥條銹病菌侵染早期及脅迫耐受性方面有重要作用，是小麥條銹病和非生物脅迫刺激響應(yīng)信號途徑的一部分［46］。ARA6作為植物RabF亞家族特有的一員也參與了鹽和滲透脅迫的調(diào)節(jié)，并且ara6突變體淀粉和糖的含量發(fā)生改變進(jìn)而導(dǎo)致糖誘導(dǎo)的防御性反應(yīng)［47］。RabA4B通過與PLANT U-BOX13（PUB13）及PI-4P互作參與依賴水楊酸的抗病反應(yīng)［48］。這些結(jié)果表明Rab參與了植物的生物和非生物脅迫響應(yīng)，但詳細(xì)的機(jī)制仍有待深入研究。

5 結(jié)語

植物中Rab形成一個由一系列不同功能蛋白組成的大家族。已經(jīng)證明Rab中存在一些從酵母到哺乳動物非常保守的信號途徑。但是，植物中Rab參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)途徑和調(diào)節(jié)發(fā)育進(jìn)程的研究方法仍處于起步階段。為了進(jìn)一步研究Rab的功能，創(chuàng)造Rab蛋白顯性失活或者組成型激活突變體是一個廣泛應(yīng)用的方法。此外，Rab上下游調(diào)控蛋白的發(fā)現(xiàn)，Rab在生物體內(nèi)活性的檢測及Rab參與信號通路的整合，對于解析Rab在植物體內(nèi)的生理功能和作用機(jī)制都具有重要的生物學(xué)意義。

值得注意的是，植物中的Rab不僅起著組成型管家功能作用，而且也參與特定過程如激素的調(diào)節(jié)、油菜素內(nèi)酯生物合成、花粉和根瘤發(fā)育及生物與非生物脅迫的響應(yīng)。Rab蛋白對生物和非生物脅迫的參與是一個重要且需要詳細(xì)研究的領(lǐng)域。Rab蛋白激活囊泡運(yùn)輸和脅迫條件下內(nèi)膜系統(tǒng)修復(fù)及保護(hù)的分子機(jī)制也需要在分子水平更詳細(xì)的研究。此外，Rab可以從耐脅迫的植物中分離和鑒定，用于提高作物抗逆性基因工程研究。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Progress on Plant Rab Family

As a kind of important small G protein，Rab family plays an integral role in various physiological activities of eukaryotic cell. Higher plants have evolved a unique set of Rab GTPases that presumably meet the specific demands of plant cell trafficking. Rab proteins involve in the regulation of plant growth and development，and the response to environmental stresses through the change of own activity by the perception of upstream signals. Here we review the research progresses of Rab family in respects of evolution characteristics，structural features，and functions of members in the signal transduction，growth and development，and stress responses in plant.

Rab；structural features；development；stress

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.003

QI Hui-jie QIN Xiao-hui LIU Ling-yun

（State Key Laboratory of Cotton Biology，College of Life Science，Henan University，Kaifeng 475004）

2015-08-28

河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目（15A180012），河南大學(xué)研究生教育綜合改革項(xiàng)目（Y1312033）

齊慧杰，女，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：植物分子生物學(xué)；E-mail：hjqi82@163.com

劉凌云，女，博士，副教授，研究方向：植物逆境生理；E-mail：lingyunl@henu.edu.cn