王慧琴 趙敏

（鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 河南鄭州 450064）

黃孢原毛平革菌降解土霉素的影響因素及酶活分析

王慧琴 趙敏

（鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 河南鄭州 450064）

目的：黃孢原毛平革菌降解土霉素的影響因素及酶活分析。方法：文章使用的方法有制備實(shí)驗(yàn)菌種和孢子懸浮液、測(cè)定校準(zhǔn)曲線及樣品與測(cè)定酶活性等。結(jié)果：培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)真菌降解抗生素和吸附重金屬特性減少然后，產(chǎn)生了酶的次生階段，不利于營(yíng)養(yǎng)的獲得，分泌了錳過氧化物酶，酶活不斷增加，達(dá)到了最大值。活躍期過后，酶活逐漸降低，在培養(yǎng)后期，產(chǎn)生的代謝物越來越多，堆集了大量的有毒代謝物，降低了錳過氧化物酶活性。討論：當(dāng)土壤濃度維持在200mg/L時(shí)，采用固化或者是非固化的方式后，黃孢原毛平革菌對(duì)土壤的降解度分別為92.44%與67.63%。在實(shí)驗(yàn)過程中，使用了兩種方式處理，但菌產(chǎn)錳過氧化物酶酶培養(yǎng)96h之后，土霉素達(dá)到了最大濃度，為70 mg/L，相應(yīng)為 527.40 U/L與73.90 U/L；使用兩種處理方式，菌產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶都要先培養(yǎng)96h之后，土霉素濃度變成了70 mg/L，這個(gè)時(shí)候是最大值，相應(yīng)為 0.384 U/L與O.204 U/L，因此，黃孢原毛平革菌降解土霉素時(shí)，起到關(guān)鍵作用的是錳過氧化物酶。文章可行性研究了黃孢原毛平革菌降解土霉素。實(shí)驗(yàn)相應(yīng)地考察了p H值、土霉素初始濃度是如何影響影響黃孢原毛平革菌降解土霉素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相應(yīng)地增加土霉素的濃度，能提升酶活，當(dāng)超過一定限度時(shí)，酶的活性會(huì)隨著增加而降低。

黃毛原毛平原革菌 講解 土霉素 酶活

隨著現(xiàn)代工業(yè)在發(fā)展，許多重金屬進(jìn)入到生態(tài)系統(tǒng)中，同時(shí)人與動(dòng)物在治療過程中還向生態(tài)環(huán)境中投放了大量抗生素。重金屬與抗生素具有連續(xù)性與積累性的特征，對(duì)環(huán)境帶來永久性污染，對(duì)空氣、水等造成了嚴(yán)重破壞。生物處理技術(shù)花費(fèi)成本低，具有可靠的操作工藝，污染較少，受到人們的普遍關(guān)注。黃孢原毛平革菌具有氧化特性和對(duì)木質(zhì)素降解沒有底物特異性［1］。黃孢原毛平革菌具有獨(dú)特的吸附與分解能力，被認(rèn)為是一種有效的生物修復(fù)劑。文章在具體研究時(shí)，在固化于分固化的條件下，分析了不同濃度對(duì)黃孢原毛平革菌的影響。采用固定方法，處理黃孢原毛平革菌后，顯著提升了降解效果與酶的活性。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器

（1）電子分析天平（BS224S，北京）；（2）高效液相色譜（LA.10A，日本））；（3）旋片式真空泵（2XZ.2，臨海）；（4）電爐、石棉網(wǎng)、牛皮紙等，恒溫水浴鍋、培養(yǎng)皿等。

1.2 方法

1.2.1 制備實(shí)驗(yàn)菌種和孢子懸浮液

在4℃時(shí)，培養(yǎng)真菌培養(yǎng)物，放置到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中。為了讓菌種處于正常生理機(jī)能的狀態(tài)，首先，要活化。因此，使用前，要將其放置在44"C下的平板上，轉(zhuǎn)移到37℃培養(yǎng)箱中，然后，轉(zhuǎn)到37℃培養(yǎng)箱中，接受24小時(shí)的活化。使用時(shí)，轉(zhuǎn)移到PDA平板，在30。C病培養(yǎng)幾天。包好將使用的、裝有適量蒸餾水的Biolog管滅菌，冷卻后，放置在濁度計(jì)上，調(diào)零，從平皿上，使用無菌棉簽，粘取適量的目標(biāo)菌孢，溶入，攪拌，讓孢子在其中分散，生成孢子懸液。在該次實(shí)驗(yàn)中，把濁度調(diào)至60%時(shí)，每毫升孢子懸浮液數(shù)量級(jí)別為2.0×16個(gè)孢子。

（1）配制0.1mol/L鹽酸溶液，選取8.33 ml特級(jí)純鹽酸，配置成0.1mol/L鹽酸溶液1L。（2）形成了0.0509/L土霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，準(zhǔn)確量取0.050 g土霉素（99.99%），兌入5m L、0.1mol/L鹽酸溶液溶解，然后，轉(zhuǎn)移到50 ml容量瓶中，同時(shí)兌入純水，使體積保持在 50 ml，混合混勻，這時(shí)配置的溶液每毫升1.00 mg土霉素。（3）準(zhǔn)確量取1.00mg/m L土霉素標(biāo)準(zhǔn)液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0與7.00m L，相應(yīng)放入7個(gè)50 m L的容量瓶中，兌入鹽酸溶液，確定好容積，搖勻，使配置的溶液濃度為 O.02 mg/m L、0.04 mg/m L、O.06 mg /m L、O.08mg/m L、0.10 mg/m L、0.12mg/m L、0.14 mg /m L的土霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 測(cè)定校準(zhǔn)曲線及樣品

（1）確保儀器狀態(tài)最佳，按照一定順序，相測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，降峰面積作為縱坐標(biāo)，把濃度作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。接著，把樣品溶液進(jìn)入液相測(cè)量，從標(biāo)準(zhǔn)曲線能獲得樣品溶液包含的土霉素濃度。（2）樣品測(cè)定依照要求，取樣后，稀釋樣品，確保濃度在l mg/L以下，經(jīng)過0.45 gm濾膜過濾，使用有效液相色譜，檢測(cè)濾液中包含的土霉素含量。

1.2.3 測(cè)定酶活性

酶是一種高分子物質(zhì)，具有生物催化功能，所以，多用來催化某一反應(yīng)能力，以此衡量酶活性。酶活性的大小，通常使用酶活力單位來表示。在本實(shí)驗(yàn)中，胞外過氧化物酶中酶活的測(cè)定主要使用紫外分光光度。這種方法具有如下優(yōu)點(diǎn)：費(fèi)用少，儀器設(shè)備與操作較為簡(jiǎn)單，具有較高的靈敏度，選擇性好，使用范圍廣，分析速度快。在錳過氧化酶活性測(cè)量體系中，通常將Mn2+作為底物；在木質(zhì)素過氧化物酶活性測(cè)量體系中，將藜蘆醇作為底物；然后，添加H202置于兩者中，產(chǎn)生啟動(dòng)反應(yīng)。該實(shí)驗(yàn)間隔12小時(shí)，取樣一次，用O.45 um濾膜過濾粗酶液，對(duì)過氧化物酶的活性，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定。（1）原理：H202啟動(dòng)反應(yīng)，藜蘆醇（VA）在木質(zhì)素過氧化物酶（Li P）催化下，被氧化為藜蘆醛，因?yàn)檗继J醇不能在310nm波長(zhǎng)處吸收，然而，藜蘆醛在310 nm波長(zhǎng)處吸收強(qiáng)。利用藜蘆醛這種特點(diǎn)，連續(xù)紫外分光光度測(cè)定，將藜蘆醇轉(zhuǎn)變?yōu)檗继J醛，作為L(zhǎng)i P活性的標(biāo)志。（2）酶活測(cè)定配制 3 ml反應(yīng)體系：粗酶液0.4m L；酒石0.1 mol/L，p H值3.0，酸緩沖液1.5m L；10mmol/L，藜蘆醇1.0m L；10mmol/LH202，啟動(dòng)反應(yīng)0.1m L。

1.2.4 降解實(shí)驗(yàn)

（1）無菌海藻酸鈉溶液80m L 4%與孢子懸浮液40m L，濃度106個(gè)/m L，混合均勻，用注射器各自注射6m L，并將混合溶液滴入無菌80m L、 4%的Ca Cl2溶液中，生成了均勻的粒徑3mm的小球，室溫下靜置4h。（2）配帶t J4L的Kirk液體培養(yǎng)基。（3）用無菌超純水，清洗3次固定化小球，轉(zhuǎn)移到剩余的l 8瓶1 00m L培養(yǎng)基中，放置在35℃、120rpm下培養(yǎng)。用錫箔紙，包好上述錐形瓶，配制不同濃度土霉素溶液，每組實(shí)驗(yàn)組設(shè)三個(gè)平行，加入以上培養(yǎng)基中，在搖床上，恒溫、避光、恒轉(zhuǎn)速，降解一定時(shí)間，接著過濾，隔12h取樣，對(duì)不同濃度的土霉素的降解效果和酶活性，分別測(cè)定固定化與未固定化的黃孢原毛平革菌帶來的影響。濾液中剩余的土霉素含量，用高效液相色譜法測(cè)定酶活性，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定。反復(fù)測(cè)每份樣品三次，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 影響土霉素降解效率

固定化的黃孢原毛平革菌對(duì)土霉素的降解率如下，土霉素的初始濃度相應(yīng)為50、70、l 00、1 30、160、200mg/L。固定化的黃孢原毛平革菌對(duì)不同濃度的土霉素具有不同的降解效率，剛開始時(shí)，土霉素的降解效顯然高于土霉素的降解效率，72h后，他們的降解速度取于平穩(wěn)。

2.2 實(shí)驗(yàn)藥品

酒石酸銨、土霉素標(biāo)準(zhǔn)品與海藻酸鈣等，試劑全是分析純。

2.3 培養(yǎng)基

本實(shí)驗(yàn)用Kirk液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的基礎(chǔ)溶液：微量元素液100 m L、葡萄糖10 g與酒石酸銨0.29等。

2.4 土霉素含量和酶活性的測(cè)定方法

本實(shí)驗(yàn)使用高效液相色譜法，對(duì)濾液中余下的土霉素含量進(jìn)測(cè)定。高效液相色譜法有“四高一廣”的特點(diǎn)：高壓、高速、高效、高靈敏度。

2.5 色譜條件

檢測(cè)波長(zhǎng)254nm；進(jìn)樣量20p L；流量0.7m L/min；柱溫為35℃；流動(dòng)相為0.1%磷酸：甲醇（40：60）；理論塔板數(shù)按土霉素峰面積計(jì)算，不小于2500。

2.6 未固定化的黃孢原毛平革菌的錳過氧化物酶（Mn P）的活性變化

在加外源物培養(yǎng)前48h，酶活小，72 h后，酶活顯著提升，主要原因在于在營(yíng)養(yǎng)限制環(huán)境下，錳過氧化物酶的活性非?；钴S，培養(yǎng)72天后，明顯減少了培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)真菌降解抗生素和吸附重金屬特性，這時(shí)的酶開始處在次生階段，限制了營(yíng)養(yǎng)，促使分泌了錳過氧化物酶，酶活最大。活躍期后，酶活開始降低。

2.7 木質(zhì)素過氧化物酶（Li P）

從上述分析中得出，固定化培養(yǎng)中的黃孢原毛平革菌的生長(zhǎng)代謝不會(huì)受到影響，同時(shí)還提高了代謝活動(dòng)與Li P酶活性。在培養(yǎng)前72 h，酶活較低，第96 h后，酶活顯著提高，主要因?yàn)槟举|(zhì)素過氧化物酶在硫限制與碳等營(yíng)養(yǎng)限制環(huán)境下相對(duì)活躍，培養(yǎng)72天后，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)開始減少，酶處在次生階段，分泌木質(zhì)素過氧化物酶。活躍后，酶活開始降低，因?yàn)樵谂囵B(yǎng)后期，代謝產(chǎn)物堆集，形成了大量的有毒代謝，嚴(yán)重影響了木質(zhì)素過氧化物酶活性。

3 討論

土霉素和重金屬濃度的增加，對(duì)于黃孢原毛平革菌的生長(zhǎng)具有潛在的抑制作用［2］。相比未固定化的黃孢原毛平革，固定化的黃孢原毛平革菌降解土霉素的降解率具有顯著優(yōu)勢(shì)，及酶的活性也高于未固定化的黃孢原毛平革。菌酶活性是因?yàn)楹Ｔ逅徕}能有效固定菌體，防止振蕩培養(yǎng)與機(jī)械攪拌因剪切力對(duì)降解酶系統(tǒng)帶來的破壞，穩(wěn)定系統(tǒng)，相比游離菌，錳過氧化物酶與木質(zhì)素過氧化物酶明顯提升了產(chǎn)量與穩(wěn)定性，保障較高的降解率與酶活性。

從上述實(shí)驗(yàn)中得出，固定化的黃孢原毛平革菌在降解土霉素時(shí)，有顯著的效果，優(yōu)于非固定化的黃孢原毛平革菌，由于有載體，便于營(yíng)養(yǎng)傳遞物質(zhì)，促進(jìn)菌絲體有效伸展，海藻酸鈣固定化對(duì)白腐菌的生長(zhǎng)與產(chǎn)酶非常有利，提高系統(tǒng)中菌體細(xì)胞酶的純度或者濃度，具有較快的反應(yīng)啟動(dòng)，取得了顯著的降解效果，比懸浮條件更加優(yōu)越，此外，還有耐高負(fù)荷能力，耐毒性與抑制雜菌的功能等。

錳過氧化物酶是糖基化過氧化物酶的一種，在培養(yǎng)黃孢原毛平革菌過程中，固定化與未固定化的黃孢原毛平革菌在培養(yǎng)96h后，兩種樣品的錳過氧化物酶在土霉素的濃度維持在70mg/L時(shí)，達(dá)到最大。在培養(yǎng)過程中，未固定化的黃孢原毛平革菌，具有較低的錳過氧化物酶活。這主要在于經(jīng)過固定化的黃孢原毛平革菌，對(duì)在振蕩培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的機(jī)械剪切力能較好地應(yīng)對(duì)，減少了細(xì)胞外酶失活與降解反應(yīng)機(jī)器關(guān)閉。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，適當(dāng)?shù)脑黾油撩顾氐臐舛?，?huì)提高酶的活性，當(dāng)超過一定限度時(shí)，酶的活性隨濃度增加而降低［3］。

［1］王慧.黃孢原毛平革菌遺傳轉(zhuǎn)化初探和錳過氧化物酶基因在瑞氏木霉中的表達(dá)［D］.山東大學(xué)，2013.

［2］李芳玲.基于重金屬及抗生素雙重作用下黃孢原毛平革菌的富集特性和抗性研究［D］.湖南大學(xué)，2014.

［3］羅湘穎.黃孢原毛平革菌降解土霉素和吸附金屬鎘的研究［D］.湖南大學(xué)，2014.

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1674-2060（2016）01-0020-02