王銳 安曉麗 梁秋波 張道旭 李鄭武

（哈藥集團(tuán)技術(shù)中心 黑龍江哈爾濱 150025）

抗人絨毛膜促性腺激素β亞單位羧基末端肽（hCG β-CTP）單克隆抗體制備及初步鑒定

王銳 安曉麗 梁秋波 張道旭 李鄭武

（哈藥集團(tuán)技術(shù)中心 黑龍江哈爾濱 150025）

本研究以重組人促紅素-CTP融合蛋白（EPO-CTP）進(jìn)行真核表達(dá)，獲得純品蛋白，免疫小鼠，采用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，獲得1株可穩(wěn)定分泌抗人絨毛膜促性腺激素β亞單位羧基末端肽（hCGβ-CTP）的雜交瘤細(xì)胞株，命名為E4。ELISA鑒定結(jié)果表明，單抗的亞型為IgG1，輕鏈為K鏈，腹水效價(jià)都在5×10-5以上。從而為驗(yàn)孕產(chǎn)品特異性的提高和以連接CTP的融合蛋白藥物的研制提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

抗人絨毛膜 hCGβ-CTP 單克隆抗體

人絨毛膜促性腺激素（human chorionie gonadotrophin，HCG）是人類(lèi)受孕后胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的維持正常妊娠必需的一種糖蛋白激素。HCG分子含有兩個(gè)亞基，分別為α和β亞基，其生物學(xué)活性和免疫學(xué)特性由β亞基決定。在妊娠早期HCG的濃度迅速增高，監(jiān)測(cè)尿中的HCG即可證實(shí)妊娠。hCG的β亞基羧基端28殘基組成的28肽是hCG分子所特有的片段，其糖含量高，可以延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期，現(xiàn)很多蛋白藥物與其連接，以達(dá)到長(zhǎng)效機(jī)制。獲得抗hCGβ羧基末端肽單克隆抗體可以進(jìn)一步提高驗(yàn)孕產(chǎn)品檢測(cè)的敏感性和特異性，并為避孕疫苗的研制和連有CTP的融合蛋白藥物的分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料

重組人促紅素-CTP融合蛋白：本室提供；胎牛血清，1640培養(yǎng)基，H T，H A T，聚乙二醇：S i g m a公司；鼠源單抗亞類(lèi)試劑盒：SouthernBiotech；其余生化試劑均為分析純。

2 方法

（1）動(dòng)物免疫。按照薩姆布魯克J等［1］報(bào)道的方法，將重組人促紅素-CTP融合蛋白作為免疫蛋白。以1μg/μL的濃度，對(duì)6只7周齡巴比西小鼠進(jìn)行免疫，每只接種100μL，間隔2周免疫一次，共3次，細(xì)胞融合于最后一次免疫后7天進(jìn)行。（2）ELISA方法的建立。以重組人促紅素-CTP融合蛋白為抗原包被ELISA板，用碳酸鹽緩沖液稀釋抗原，方陣法確定蛋白最佳包被濃度和陰陽(yáng)性血清的最佳稀釋倍數(shù)，經(jīng)HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG作用，鄰苯二胺底物顯色，判定結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)為陽(yáng)性血清孔的OD492值接近1.0，陰性血清OD492值＜0. 2，P/N≥2.1。（3）細(xì)胞融合及篩選?？寡逍r(jià)檢測(cè)于第3次免疫后7天進(jìn)行。取脾細(xì)胞與Sp2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞，按常規(guī)方法進(jìn)行融合，HA T篩選融合細(xì)胞，采用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行篩選，達(dá)到1 0 0%陽(yáng)性者擴(kuò)大培養(yǎng)，建株保存。（4）單抗亞類(lèi)鑒定。按SouthernBiotech公司亞類(lèi)試劑盒說(shuō)明書(shū)用ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)。（5）腹水制備。采用體內(nèi)誘生腹水法，按常規(guī)方法制備腹水。用建立的ELISA檢測(cè)方法測(cè)定單抗腹水效價(jià)，以P/N≥2.0的抗體最大稀釋度作為效價(jià)終值。（6）抗體識(shí)別特異性鑒定。用雜交瘤細(xì)胞腹水純化后蛋白做免疫印跡分析，結(jié)果證實(shí)本試驗(yàn)所獲得的單抗能與人絨毛膜促性腺激素β亞單位羧基末端肽反應(yīng)，說(shuō)明篩選得到的單抗可以特異性識(shí)別人絨毛膜促性腺激素β亞單位羧基末端肽，進(jìn)一步證實(shí)了所獲得單抗的特異性。（7）雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定性分析。對(duì)已獲得的1株雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行30次傳代，以免疫鼠血清為陽(yáng)性對(duì)照，以空白鼠血清為陰性對(duì)照，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液并測(cè)其效價(jià)。

3 結(jié)果

（1）間接ELISA方法結(jié)果。將重組人促紅素-CTP融合蛋白原液，分別以4μg/ml，2μg/ml，1μg/ml和0.5μg/ml的濃度包被ELISA板，陽(yáng)性和陰性血清稀釋倍數(shù)為1：100、1：500、1：1000，結(jié)果顯示，抗原濃度在1μg/ml，血清稀釋倍數(shù)為1/1000時(shí)，P/N≥2.1。（2）雜交瘤細(xì)胞的融合率。本試驗(yàn)經(jīng)過(guò)3次細(xì)胞融合，細(xì)胞的融合率達(dá)到了85.8 %。（3）細(xì)胞株的建立。細(xì)胞融合后，判定為陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞經(jīng)3次克隆篩選，獲得能夠穩(wěn)定分泌抗人絨毛膜促性腺激素β亞單位羧基末端肽單抗細(xì)胞株，命名為E4。（4）單抗亞類(lèi)鑒定。經(jīng)單克隆抗體亞類(lèi)鑒定試劑盒檢測(cè)，所獲雜交瘤細(xì)胞，均為IgG1型，且都是K輕鏈抗體。（5）單抗腹水效價(jià)測(cè)定。獲得腹水電泳純度在95%以上，經(jīng)鑒定表明單抗腹水的間接ELSIA效價(jià)都在10-5以上。（6）單抗特異性鑒定。經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜的蛋白進(jìn)行單抗孵育。結(jié)果顯示單抗能特異性的識(shí)別人絨毛膜促性腺激素β亞單位羧基末端肽。（7）細(xì)胞分泌抗體穩(wěn)定性分析結(jié)果。雜交瘤細(xì)胞株經(jīng)30次傳代，能持續(xù)并穩(wěn)定分泌抗體。

4 討論

本研究以重組人促紅素-CTP融合蛋白為免疫原，免疫巴比西小鼠，獲得一株抗人絨毛膜促性腺激素β亞單位羧基末端肽單抗，命名為E4。經(jīng)鑒定，該株單抗亞類(lèi)為IgG1，輕鏈為K鏈；雜交瘤細(xì)胞連續(xù)傳代30次，其分泌抗體的能力較穩(wěn)定；腹水效價(jià)均達(dá)到10-5以上；免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明，該株單抗能夠特異性識(shí)別人絨毛膜促性腺激素β亞單位羧基末端肽。目前市場(chǎng)上的驗(yàn)孕產(chǎn)品，捕獲抗體大多是針對(duì)非CTP段抗原表位的抗體，而人的hCGβ與LHβ同源非常高［2］，主要差異就在CTP段，這會(huì)給檢測(cè)造成假陽(yáng)性。因此CTP單抗的研制，對(duì)于驗(yàn)孕產(chǎn)品的特異性提高有很大幫助。

目前治療性生物制品的研發(fā)日趨火熱，為了提高蛋白類(lèi)藥物的半衰期，CTP短肽成為各大藥企研究熱點(diǎn)。鑒于此我們研究并制備了人絨毛膜促性腺激素β亞單位羧基末端肽單抗，從而為驗(yàn)孕產(chǎn)品和長(zhǎng)效藥物的研制都提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

［1］薩姆布魯克 J，拉塞爾 DW（黃培堂，等譯）.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南［M］.北京：科學(xué)出版社，2002，1474-1480.

［2］黃樹(shù)峰.綜述 姜衛(wèi)國(guó) 審枝.人絨毛膜促性腺激素測(cè)定在婦產(chǎn)科的應(yīng)用（200605）.

S859.2

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1674-2060（2016）02-0202-01