羅　杰，張宿義，，敖宗華，王松濤，稅梁揚(yáng)，楊　艷，李德林，張　兵（.瀘州龍泉窖酒業(yè)有限公司，四川瀘州66606；.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州66000；3.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州66000；.瀘州科源生物科技有限公司，四川瀘州66606）

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濃香型白酒窖池窖泥中原核微生物菌群的研究

羅杰1，張宿義1，2，3，敖宗華2，3，王松濤2，稅梁揚(yáng)4，楊艷4，李德林4，張兵4
（1.瀘州龍泉窖酒業(yè)有限公司，四川瀘州646606；2.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州646000；3.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州646000；4.瀘州科源生物科技有限公司，四川瀘州646606）

摘要：提取濃香型窖池窖壁泥和窖底泥樣品總DNA，構(gòu)建窖泥細(xì)菌16S rRNA文庫，經(jīng)過16S rRNA擴(kuò)增片段的限制性酶切分析(ARDRA)、DNA序列測定和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析，對比研究了窖壁泥和窖底泥細(xì)菌群落組成。數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，窖池窖壁泥和窖底泥中細(xì)菌種類及數(shù)量的差異性較大。窖壁泥中優(yōu)勢菌屬為Clostridiumsp、Caloramatorsp和Desulfotoma- culum carboxydivorans，所占比例分別為17％、8％和6％。窖底泥優(yōu)勢菌屬為Clostridium acidurici、Ruminococcus bromii、Proteiniphilumsp和Parabacteroides merdae，所占比例分別為18％、8％、7％ 和6％。初步揭示了窖池窖壁泥和窖底泥中細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育多樣性及相互之間存在的差異。

關(guān)鍵詞：窖泥；16S rRNA序列；克隆文庫；白酒

窖泥在濃香型白酒發(fā)酵過程中具有重要的作用，它是窖泥功能菌生長繁殖的載體，也是濃香型白酒呈香呈味物質(zhì)生成的主要場所。因此研究濃香型白酒窖泥微生物的菌群組成和動態(tài)變化，對于進(jìn)一步分離和開發(fā)應(yīng)用窖泥微生物資源、了解窖泥微生物與白酒發(fā)酵之間的關(guān)系具有重要的意義。目前，大多數(shù)研究主要還是采用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)結(jié)合分子生物學(xué)手段，從可培養(yǎng)的角度針對不同窖齡、不同地域的窖泥中可培養(yǎng)微生物的數(shù)量、群落組成及動態(tài)變化進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究[1-2]，并且分離、鑒定出很多以前從未報道的窖泥微生物[3-6]。

然而，由于窖泥中可分離培養(yǎng)的微生物僅占窖泥微生物的極少數(shù)，因此采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法難以全面的反映窖泥生態(tài)系統(tǒng)微生物群落組成及演替規(guī)律。近年來，隨著微生物生態(tài)學(xué)的發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)越來越多的應(yīng)用于窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)和動態(tài)變化規(guī)律的研究，利用16S rRNA技術(shù)對窖泥中未培養(yǎng)微生物的多樣性及系統(tǒng)發(fā)育的研究得以飛速發(fā)展[7-14]。

窖池不同空間位置窖泥所處的微生態(tài)不盡相同，窖泥中微生物群落存在典型的空間異質(zhì)性，不同層面窖泥的生態(tài)因子也存在一定的差異。這種差異影響著窖泥中微生物的繁殖與代謝，對中國濃香型白酒風(fēng)味的形成起著重要作用。鑒于此，本研究以窖池窖壁泥和窖底泥為對象，利用16S rRNA技術(shù)構(gòu)建窖泥原核微生物克隆文庫，探索不同層面窖泥中細(xì)菌群落構(gòu)成，并結(jié)合相關(guān)微生物的特性對窖池生香原理進(jìn)行討論，為探索濃香型白酒風(fēng)味物質(zhì)形成機(jī)理提供了一定科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1樣品采集

窖泥樣品：采集自某濃香型名酒企業(yè)釀酒車間。窖壁泥的取樣方法是從該窖池四周窖壁接近中心一點(diǎn)各取5 g窖泥，將窖壁泥混合均勻，分裝后密封冷凍保存。窖底泥的取樣方法是從窖底四個角落和接近中心點(diǎn)各取5 g窖泥，將窖底泥混合均勻，分裝后密封冷凍（-80℃）保存。

1.2試劑與儀器

DNA提取試劑盒，dNTP，Taq DNA聚合酶，HinfI和Csp6I購自上海生工生物公司；X-gal(50mg/mL)，IPTG (0.5 mM)，氨芐青霉素(50mg/mL)，Tripton(4％)；PCR擴(kuò)增引物由上海生工生物公司合成。

高速冷凍離心機(jī)（SIGMA），DyNA Quant 200濃度測定儀（美國，PHARMACIABIOTECH），核酸電泳儀（BIORAD），GDS凝膠成像系統(tǒng)（英國，UVP），臺式離心機(jī)（上海安亭儀器廠），PCR儀（美國PE公司，MJ），人工氣候培養(yǎng)箱（哈爾濱東明醫(yī)療儀器廠），自動滅菌鍋（日本，SANYO），超低溫冰箱（-80℃）（美國，F(xiàn)ORMA SCIENTIFIC），電子天平（美國，SARTORIUS）。

1.3窖泥樣品的預(yù)處理和總DNA提取

取1～2 g窖泥樣品，用5 mL 0.1 M的磷酸緩沖液（pH7.0）懸浮，加入玻璃珠，漩渦振蕩器充分振蕩5 min。200×g離心5 min，收集上清液（含菌體），棄去沉淀，洗滌3次，200×g離心5 min，收集上清液（含菌體），棄去沉淀。9000×g高速離心5 min，棄上清液，收集沉淀（菌體）。收集的菌體用5 mL 0.1 M的磷酸緩沖液（pH7.0）懸浮，9000×g離心5 min，洗滌3次。洗凈的菌體懸浮在5 mL磷酸緩沖液（pH7.0）中，用槍吹打后漩渦振蕩器振蕩均勻。然后按試劑盒上的操作步驟提取窖泥DNA。

1.4細(xì)菌16S rRNA基因克隆文庫的構(gòu)建與測序與比對

細(xì)菌16S rRNA全長的PCR擴(kuò)增所用的引物采用Di CelloF等所用的引物，可以擴(kuò)增16S rRNA約1.5 kb的片段。序列如下；P0：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；P6：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'。PCR擴(kuò)增條件為：94℃變性4 min，接下來30個循環(huán)，分別是94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min 45 s，最后一個循環(huán)72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳分離檢驗，電壓約11 V/cm，電泳時間30 min。通過膠回收試劑盒回收純化，純化后的PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T easy vector載體上。再將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10B化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，涂布于加有100μL 0.5 Mm IPTG和25μL 50mg/mL的X-Gal的Amp選擇性平板上涂板。37℃培養(yǎng)16 h后，用滅菌的牙簽隨機(jī)挑取192個窖壁泥細(xì)菌陽性克隆子編號50B（1-192）和192個窖底泥細(xì)菌陽性克隆子編號50D（1-192），加入2 mL EP管中（含有Amp 的LB液體培養(yǎng)基），37℃過夜培養(yǎng)，長出單菌落后放4℃?zhèn)溆?。再通過菌落PCR確定陽性克隆子，用移液槍吸取10μL菌液懸于20μL 0.5％ Tripton-100中，室溫靜置10 min，離心機(jī)6000×g離心1 s，使用時取3μL上清液作為模板。引物對T7（5'-GGCCGCGGGAATTC GATT-3'）/SP6（5'-GCGAATTCACTA GTGATT-3'），擴(kuò)增程序同上。用限制性內(nèi)切酶HinfI（MBI）和Csp6I（promega）消化提取的重組質(zhì)粒50B（1-192號）和50D（1-192號）。酶切反應(yīng)均在37℃下水浴消化3 h，酶切產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離，電壓11 V/cm，時間45 min，EB染色。根據(jù)酶切圖譜對克隆進(jìn)行分型，綜合比較2種內(nèi)切酶酶切結(jié)果，對窖壁泥和窖底泥分別選取84個和80個陽性克隆子，委托上海捷瑞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定。

得到的序列通過Genebank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）進(jìn)行比較鑒定，尋找與目的序列同源性較高且通過聚類分析能聚到一類的已知分類地位的菌種的16S rRNA序列。通過BioEdit和Clustal X程序多重比對后用Mega5.05軟件Neighbor-Joining法進(jìn)行1000次步長計算構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹圖[16-17]。

2　結(jié)果與分析

將測得的細(xì)菌16S rRNA序列與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。每一條16S rRNA基因文庫內(nèi)的序列均與數(shù)據(jù)庫中相似性較高的序列進(jìn)行聚類分析，然后選擇聚類的自展支持率較高的序列。結(jié)果表明，克隆子與數(shù)據(jù)庫內(nèi)參比序列間相似度較高，達(dá)到80％～100％，它們大多數(shù)與土壤、堆肥、厭氧生物反應(yīng)器等環(huán)境中的不可培養(yǎng)微生物或可培養(yǎng)微生物相關(guān)。由于分析的序列較多，針對窖壁泥和窖底泥細(xì)菌16S rRNA基因文庫內(nèi)的厚壁菌門克隆子分別構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖1、圖2）。

兩個克隆文庫中都檢測到厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門的微生物，而且厚壁菌門所占比例是最高的。變形菌門僅在窖壁泥中鑒定出，Synergistetes僅存在于窖底泥中。研究表明窖壁泥和窖底泥菌群結(jié)構(gòu)存在明顯差異（各門所占比例詳見圖3）。

圖1　基于厚壁菌門克隆子序列構(gòu)建的窖壁細(xì)菌16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹

窖壁文庫得到37個OTUS，主要分布于16科和7個科級分類未知的梭菌綱和擬桿菌綱類群內(nèi)。窖底文庫得到35個OTUS，主要分布于14個科和9個科級分類未知的梭菌綱類群內(nèi)。窖壁泥中的優(yōu)勢菌屬為Clostridium sp.、Caloramatorsp和Desulfotomaculum carboxydivorans，窖底泥中的優(yōu)勢菌屬為Clostridium acidurici、Ruminococcus bromii、Proteiniphilumsp和Parabacteroides merdae（詳見表1）。

窖壁和窖底克隆文庫中克隆子16S rRNA序列的比對結(jié)果見表2。

從表2可知，窖泥中微生物種類較多，其中大部分微生物在窖壁泥和窖底泥中均有分布。對存在于窖壁泥中微生物主要功能特性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：腸桿菌屬（Enterobacter）兼性厭氧，發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣(通常CO2∶H2=2 ∶1)；醋桿菌屬（Acetobacter）能夠在有空氣的條件下將乙醇轉(zhuǎn)化為乙酸；假黃色單胞菌屬（Pseudoxa-nthomonas）嗜熱厭氧具有降解亞硝酸鹽的能力；嗜酸棲熱菌屬（Acidothermus）最適生長溫度55℃，能分泌糖苷水解酶和碳水化合物酯酶，這些水解酶能夠水解植物細(xì)胞壁和其他的一些碳水化活物；纖維菌屬（Cellulomonas）化能異養(yǎng)菌，可呼吸代謝也可發(fā)酵代謝，在好氧和厭氧條件下都能利用葡萄糖和其他碳水化合物產(chǎn)酸；Moorella嗜熱微生物，能產(chǎn)乙酸；Unclassified Ruminococcaceae能降解纖維素；乳酸菌（Lactobacillus）發(fā)酵分解糖代謝，終產(chǎn)物中50％以上是乳酸，最適生長溫度30～40℃。

圖2　基于厚壁菌門克隆子序列構(gòu)建的窖底細(xì)菌16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹

針對存在于窖底泥中微生物主要功能特性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：Aminobacterim與甲烷菌存在共生關(guān)系[18-21]；Unclassified Peptostreptococcaceae營養(yǎng)需求復(fù)雜，可發(fā)酵氨基酸或碳水化合物產(chǎn)生低級脂肪酸、二氧化碳和氫，有時可產(chǎn)生琥珀酸或乙醇，通過異型發(fā)酵形成乳酸，但一般不是主要產(chǎn)物；Alkalitalea可發(fā)酵甘油、果糖和乳酸。

3　討論

通過對窖壁泥和窖底泥克隆文庫的分析，厚壁菌門(Firmicute)和擬桿菌門（Bacteroidetes）均為窖壁泥和窖底泥中兩大優(yōu)勢菌群。其中窖壁泥中有少量的變形菌門克隆子，窖底泥中存在一定的Synergistetes門克隆子。窖壁泥和窖底泥中優(yōu)勢菌屬存在一定的差異：窖壁泥中的優(yōu)勢菌屬為Clostridiumsp、Caloramatorsp和Desulfo-tomaculum carboxydivorans，所占比例分別為17％、8％ 和6％。窖底泥中的優(yōu)勢菌屬為Clostridium acidurici、Ruminococcus bromii、Proteiniphilumsp和Parabacteroides merdae，所占比例分別為18％、8％、7％和6％。

圖3　16S rRNA克隆文庫中操作分類單元和克隆子在不同門的分布

表1　窖壁泥和窖底泥樣品中優(yōu)勢菌屬在細(xì)菌域的序列比對

長期生產(chǎn)實(shí)踐表明：由于窖底糟醅與窖泥的接觸面積最大，故窖池底部被認(rèn)為是整窖中生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)調(diào)味酒的主要區(qū)域，而中層糟醅及上層糟醅的酒質(zhì)相對差一些。這或許與窖壁泥、窖底泥微生物差異性有關(guān)。

運(yùn)用16S rRNA技術(shù)分析窖壁泥和窖底泥的微生物群落結(jié)構(gòu)，研究傳統(tǒng)食品發(fā)酵功能微生物的生態(tài)特征與規(guī)律，將其與傳統(tǒng)的菌種分離鑒定和白酒固態(tài)發(fā)酵檢測等手段相結(jié)合，對判斷和鑒定白酒生產(chǎn)中與特征風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)的關(guān)鍵微生物、指導(dǎo)生產(chǎn)工藝改進(jìn)，具有重要的理論和實(shí)踐意義。

表2　濃香型白酒50年窖泥16S rDNA克隆文庫中窖壁和窖底克隆子在不同屬的分布

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Prokaryotic Bacteria Communities in Pit Mud of Nongxiang Baijiu

LUO Jie1，ZHANG Suyi1,2,3，AO Zonghua2,3，WANG Songtao2，SHUI Liangyang4，YANG Yan4，LI Delin4and ZHANG Bing4
(1.Luzhou Longquanjiao Distillery Co.Ltd.,Luzhou,Sichuan 646606;2.Luzhou Laojiao Co.Ltd.,Luzhou,Sichuan 646000；3.National Engineering Technology Research Center of Solid-state Brewing,Luzhou,Sichuan 646000；4.Luzhou Keyuan Biological Technology Co.Ltd.,Luzhou,Sichuan 646606,China)

Abstract:Total DNA were extracted from pit wall mud and pit bottom mud for Nongxiang Baijiu production for the construction of clone libraries of 16S rRNA.The bacteria composition and diversity in pit mud between pit wall and pit bottom were contrasted by amplified 16S rRNA restriction analysis (ARDRA),DNA sequencing and phylogenetic analysis.The results showed that there was significant difference in the varieties and the quantity of bacteria from pit wall mud and pit bottom mud,the dominant bacteria species in pit wall mud included Clostridiumsp,Caloramatorsp and Desulfotomaculum carboxydivorans (17％,8％ and 6％ of total bacteria quantity),the dominant bacteria species in pit bottom mud included Clostridium acidurici,Ruminococcus bromii,Proteiniphilumsp and Parabacteroides merdae (18％,8％,7％ and 6％ of total bacteria quantity).This research preliminarily revealed the difference in bacteria diversity between pit wall mud and pit bottom mud.

Key words:pit mud;16S rRNAsequence;clone library;Baijiu

通訊作者：敖宗華（1971-），男，博士，碩士生導(dǎo)師，高級工程師，發(fā)表學(xué)術(shù)論文數(shù)十篇，E-mail：aozh@lzlj.com.cn。

作者簡介：羅杰（1989-），男，四川榮縣人，碩士，主要從事釀酒生物技術(shù)與應(yīng)用。

收稿日期：2015-10-16

中圖分類號：TS262.3；TS261.4；TS261.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）02-0055-06

DOI：10.13746/j.njkj.2015404

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2015-12-30；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20151230.0923.005.html。