孫 　 蕾，　李 　 成，　馬 樹(shù) 瑞，　崔 　 靜，　牛 慶 昌，　叢 麗 娜

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連　116034 )

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一株紅酵母的篩選、鑒定及硝化作用

孫 蕾，李 成，馬 樹(shù) 瑞，崔 靜，牛 慶 昌，叢 麗 娜

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連116034 )

摘要:從海參腸道中篩選出一株紅酵母菌HS-J4，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)、培養(yǎng)特性分析及26S rDNA序列測(cè)定，建立了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，初步鑒定該菌株為膠紅酵母。通過(guò)測(cè)定紅酵母的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，確定紅酵母的最佳發(fā)酵時(shí)間為24 h，并檢測(cè)了膠紅酵母HS-J4對(duì)實(shí)驗(yàn)室配制的人工污水及海參養(yǎng)殖污水中亞硝酸鹽和氨氮的清除能力。結(jié)果表明，HS-J4菌體對(duì)人工污水中高濃度的氨氮和亞硝酸鹽氮均有良好的去除效果，清除率分別為42.3%和34.8%。應(yīng)用于海參養(yǎng)殖污水時(shí)，HS-J4對(duì)水體中亞硝酸鹽的去除率達(dá)到56.8%。篩選得到的膠紅酵母HS-J4具有較高的硝化能力，可為養(yǎng)殖水質(zhì)改良的實(shí)際生產(chǎn)提供有效參考。

關(guān)鍵詞:紅酵母菌；氨氮；亞硝酸鹽氮

0引言

為滿(mǎn)足人們對(duì)海參產(chǎn)品日益增多的需求，遼東半島海參養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，養(yǎng)殖出現(xiàn)集約化，逐漸增加餌料的投入量、藥物的使用量等[1]。這使得海參養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽含量日益增加，嚴(yán)重影響海參的健康[2]。養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽是水產(chǎn)動(dòng)物致病的重要根源，其濃度過(guò)高會(huì)引起水體動(dòng)物中毒死亡。因此，去除海參養(yǎng)殖水體的亞硝酸鹽氮是目前領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[3]。

目前，通過(guò)微生物的反硝化作用可以去除養(yǎng)殖水體中的亞硝酸鹽[4]。近些年，利用微生物(真菌、細(xì)菌、酵母菌)降解養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽的研究及其應(yīng)用受到人們的高度重視[5-6]。其中，酵母菌屬中的紅酵母在凈化養(yǎng)殖水質(zhì)方面應(yīng)用較廣。例如，李靜等[7-8]為了探索具有食品安全性的亞硝酸鹽去除方法，研究了深紅酵母降解亞硝酸鹽的工藝條件和粘紅酵母好氧反硝化的特性；吳偉等[9]對(duì)影響假絲酵母降解亞硝酸鹽的各種主要因素進(jìn)行了研究。以上結(jié)果表明紅酵母菌屬對(duì)亞硝酸鹽具有一定的清除能力。

本實(shí)驗(yàn)立足從海參體內(nèi)篩選出具有硝化能力的紅酵母菌，為海參養(yǎng)殖水質(zhì)凈化益生菌的開(kāi)發(fā)提供優(yōu)良菌株和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌種

菌種篩選所用樣本來(lái)自遼寧省大連市長(zhǎng)海縣參養(yǎng)殖圈內(nèi)海水及海參腸道。

1.1.2培養(yǎng)基

篩選富集培養(yǎng)基：稱(chēng)取去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，1 L水煮沸1 h，過(guò)濾添加去離子水至1 L。

YEPD培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉10 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，去離子水1 L，自然pH。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，硫酸銨15 g，磷酸二氫鉀2.5 g，去離子水1 L，pH 6.7

1.2方法

1.2.1紅酵母的篩選

富集：取樣大連長(zhǎng)?？h海參，在無(wú)菌條件下將海參腸道取出、剪碎，無(wú)菌生理鹽水沖洗2～3次，將沖洗液及剪碎的海參腸一同放入含有小玻璃珠的富集培養(yǎng)基，30 ℃、160 r/min富集培養(yǎng)48 h。

純化：將富集培養(yǎng)液以5%的接菌量，接入滅菌后加入100 mg/L青霉素(青霉素藥物會(huì)殺死細(xì)菌和霉菌，為酵母菌提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境[10-11])的YEPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min培養(yǎng)48 h。將菌液進(jìn)行10-1～10-9的梯度稀釋?zhuān)桨逋坎荚赮EPD固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)48 h。挑取顏色大小不同的菌株進(jìn)行菌落劃線(xiàn)分離純化，直至在顯微鏡下觀察為純種酵母細(xì)胞。根據(jù)菌落形態(tài)和顏色篩選出一株紅酵母，將得到的菌株于YEPD斜面培養(yǎng)基4 ℃保藏。

1.2.2紅酵母的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定:將篩選得到的紅酵母菌制片，在顯微鏡下觀察酵母菌的細(xì)胞形態(tài)。

分子生物學(xué)鑒定:由寶生物工程有限公司對(duì)菌株進(jìn)行26S rDNA D1/D2區(qū)序列測(cè)定。

系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建:將測(cè)序結(jié)果提交GenBank，根據(jù)同源序列搜索結(jié)果，下載相關(guān)菌種的26S rDNA 序列[12]。進(jìn)行序列比對(duì)，選取相似性最高的9條序列，使用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3紅酵母生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

將篩選的紅酵母進(jìn)行活化，4%接種量接種發(fā)酵培基，30 ℃、160 r/min培養(yǎng)。采用比濁法進(jìn)行測(cè)定。對(duì)細(xì)胞密度大的培養(yǎng)液用空白發(fā)酵培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后測(cè)定，測(cè)得的光密度為0.1～0.65。

1.2.4紅酵母對(duì)氨氮、亞硝酸鹽的清除能力

配置人工污水(氨氮1.25 mg/L，亞硝酸鹽7 mg/L，pH 7.0)，將紅酵母菌株培養(yǎng)液離心(4 000 r/min、15 min)收集濕菌體，按10 g/L 接入，于28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)5 d。24 h取樣1次，分別檢測(cè)紅酵母對(duì)人工污水中氨氮和亞硝酸鹽的清除能力及水體pH的變化。

1.2.5紅酵母對(duì)海參養(yǎng)殖污水的凈水能力

選取海參育苗池倒池前的養(yǎng)殖污水(鑫玉龍海參養(yǎng)殖公司，起始氨氮0.762 mg/L，亞硝酸鹽1.865 mg/L，pH 7.14)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分別檢測(cè)HS-J4 對(duì)海參養(yǎng)殖水體中氨氮和亞硝酸鹽的清除能力及對(duì)水質(zhì)pH的影響。

1.2.6亞硝酸鹽的測(cè)定

采用鹽酸N-(1-萘)-乙二胺光度法測(cè)定上清液的亞硝酸鹽[13]。每次取5 mL水樣， 12 000 r/min離心20 min，收集上清液，檢測(cè)海參養(yǎng)殖水體在不同時(shí)間的亞硝酸鹽含量。

1.2.7氨氮的測(cè)定

采用水楊酸-次氯酸鹽光度法測(cè)定上清液的氨氮含量[14]。每天取5 mL水樣于12 000 r/min離心20 min，收取上清液，檢測(cè)海參養(yǎng)殖水體在不同時(shí)間的氨氮含量。

2結(jié)果與分析

2.1紅酵母菌株的篩選及形態(tài)學(xué)分析

通過(guò)富集、純化，共篩選出10株酵母菌。根據(jù)菌落顏色從中篩選出一株紅酵母，命名為HS-J4。在10×40顯微鏡下，觀察菌落形態(tài)呈圓形(圖1(a))，以出芽的方式進(jìn)行生殖(無(wú)性生殖，圖1(b))。

圖1　HS-J4菌落形態(tài)及光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)

2.2分子生物學(xué)鑒定HS-J4菌株的種屬

對(duì)菌株HS-J4進(jìn)行26S rDNA分子生物學(xué)鑒定，測(cè)序長(zhǎng)度為526 bp。序列已提交到GenBank，檢索號(hào)為KF6682430.1。

2.3構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

測(cè)序得HS-J4菌株的26S rDNA序列，利用NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/pubmed/)的“Blast”進(jìn)行比對(duì)。經(jīng)序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中與HS-J4序列相近的菌株屬于紅酵母屬(Rhodotorula)。

根據(jù)Blast比對(duì)結(jié)果，選取與HS-J4高度相似性的9條序列，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建(圖2)。HS-J4菌株位于Rhodotorula獨(dú)立分支上，與菌株RhodotorulamucilaginosaWT6-5的序列覆蓋度為100%，最大序列相似度到達(dá)99%。通常認(rèn)為，同種間菌株的大亞基5′端D1/D2區(qū)域的差異不超過(guò)1%[15]。由此可以確定HS-J4菌株均屬于膠紅酵母菌種(Rhodotorulamucilaginosa)。

圖2　菌株HS-J4及其相關(guān)菌株的26S rDNA基因全序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4測(cè)定HS-J4的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

測(cè)定培養(yǎng)液不同時(shí)段的OD600，繪制HS-J4生長(zhǎng)曲線(xiàn)(圖3)。菌株HS-J4在0～5 h為生長(zhǎng)延滯期；從5 h開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；24 h后，菌體停止分裂，進(jìn)入平臺(tái)期。根據(jù)HS-J4菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，確定后續(xù)投入養(yǎng)殖水體中的菌體為發(fā)酵24 h的HS-J4發(fā)酵濕菌體。

圖3　HS-J4生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖

2.5HS-J4凈水能力的檢測(cè)結(jié)果與分析

2.5.1HS-J4對(duì)人工污水和海參養(yǎng)殖污水亞硝酸鹽氮的清除作用

將濕菌泥10 g/L接入污水中，檢測(cè)膠紅酵母HS-J4對(duì)人工污水和海參養(yǎng)殖污水中亞硝酸鹽氮的凈化情況(圖4)。由圖4可知，HS-J4投入人工污水1～2 d亞硝酸鹽迅速下降，去除率達(dá)34.8%。養(yǎng)殖水體投入濕菌泥后，亞硝酸鹽氮去除率快速上升，第3天，HS-J4對(duì)水體中亞硝酸鹽氮的去除率達(dá)56.8%；4 d后，水體內(nèi)的亞硝酸鹽氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)略有升高，處于水體最初的亞酸鹽氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的60%左右。結(jié)果表明，HS-J4對(duì)高濃度和低濃度亞硝酸鹽氮都具有明顯的、快速的清除作用。

圖4HS-J4菌株對(duì)人工和養(yǎng)殖污水中亞硝酸鹽的清除率

Fig.4ThescavengingratesofnitritenitrogenintheartificialandaquaculturewastewaterbyHS-J4strain

2.5.2HS-J4對(duì)人工污水和海參養(yǎng)殖污水氨氮的清除作用

將濕菌泥10 g/L接入污水中，檢測(cè)膠紅酵母HS-J4對(duì)人工污水和海參養(yǎng)殖污水氨氮的清除能力(圖5)。由圖5可知，HS-J4對(duì)人工污水具有明顯的去除作用，第2天去除率達(dá)到最高42.3%。根據(jù)測(cè)定，海參養(yǎng)殖污水初始的氨氮含量很低，投入濕菌泥后海參養(yǎng)殖污水的氨氮去除率緩慢升高，第3天HS-J4對(duì)水體中氨氮的清除率達(dá)8%。4～5 d氨氮含量總體水平保持穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HS-J4對(duì)高濃度的氨氮具有明顯的清除作用，對(duì)養(yǎng)殖水體中氨氮具有一定的去除能力。

圖5　　　HS-J4菌株對(duì)人工和養(yǎng)殖污水中氨氮

Fig.5ThescavengingratesofammonianitrogenintheartificialandaquaculturewastewaterbyHS-J4strain

由圖6可知人工污水的pH整個(gè)過(guò)程有明顯的下降。海參養(yǎng)殖污水1～4d水質(zhì)維持pH7.0左右，在整個(gè)過(guò)程中水質(zhì)pH6.8～7.0保持平穩(wěn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明紅酵母在養(yǎng)殖水質(zhì)惡化狀態(tài)下可以發(fā)揮去除氨氮、亞硝酸鹽氮的作用。

圖6　　　　HS-J4菌株對(duì)人工和養(yǎng)殖污水中水質(zhì)

3結(jié)論

從海參腸道中篩選出了一株紅酵母命名為HS-J4，通過(guò)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定為膠紅酵母菌。膠紅酵母對(duì)人工污水和養(yǎng)殖污水中的亞硝態(tài)氮去除率分別達(dá) 34.8%和56.8%，對(duì)人工污水中高氨氮的除率達(dá)42.3%，對(duì)于低氨氮的養(yǎng)殖污水去除能力較低。因此，膠紅酵母HS-J4具有降解氨氮、亞硝酸鹽，改善養(yǎng)殖環(huán)境的作用，為開(kāi)發(fā)海參養(yǎng)殖水體水質(zhì)改良劑提供可選菌株。

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Screening, identification and nitrification of a marineRhodotorulastrain

SUNLei,LICheng,MAShurui,CUIJing,NIUQingchang,CONGLina

( School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

Abstract:A marine Rhodotorula strain named HS-J4 was isolated from sea cucumber intestine. It was identified as a Rhodotorula mucilaginosa strain analysed by the characterization of morphology, 26S rDNA and the phylogenic tree. The best fermentation time for cell growth of HS-J4 was 24 h, and the scavenging activities for the nitrite and ammonia nitrogen in artificial wastewater and aquaculture wastewater was determined. The results showed that the removal rates of the ammonia nitrogen and nitrate could reach to 42.3% and 34.8% in the artificial wastewater, while the removal rate of nitrate was 56.8% in aquaculture wastewater for sea cucumber. The results showed that HS-J4 had high capability of removing the nitrite and ammonia nitrogen, which laid a good foundation for the further application in the aquaculture water.

Key words:Rhodotorula; ammonia nitrogen; nitrate nitrogen

中圖分類(lèi)號(hào):TS254.2；S917.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

作者簡(jiǎn)介:孫 蕾(1990-)，女，碩士研究生；通信作者：叢麗娜(1962-)，女，教授，E-mail:congln@dlpu.edu.cn.

基金項(xiàng)目:海洋公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(201405003-3)；遼寧省高等學(xué)校重大科技平臺(tái)專(zhuān)項(xiàng)(LT2011008).

收稿日期:2015-02-02.

文章編號(hào):1674-1404(2016)02-0088-04