趙旦博， 任婷婷， 程明亮**， 禹　萍

(1.貴州醫(yī)科大學 感染病學教研室, 貴州 貴陽　550004； 2.貴州醫(yī)科大學 生化教研室， 貴州 貴陽　550004)

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藍莓對非酒精性脂肪肝大鼠Nqo1蛋白表達的影響*

趙旦博1， 任婷婷2， 程明亮1**， 禹萍1

(1.貴州醫(yī)科大學 感染病學教研室, 貴州 貴陽550004； 2.貴州醫(yī)科大學 生化教研室， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 探討藍莓對非酒精性脂肪肝大鼠的保護作用及機制。方法: 40只健康SD大鼠隨機均分為正常組、藍莓組、異甘草酸鎂組及模型組，除正常組用普通飼料喂養(yǎng),其余各組均使用高脂飼料喂養(yǎng)，藍莓組與異甘草酸鎂組在每日固定時間分別灌服藍莓漿及異甘草酸鎂溶液，正常組和模型組灌服等量生理鹽水，8周后處死所有大鼠，取肝組織切片油紅染色觀察各組肝臟脂肪變情況, 采用自動生化儀檢測血清谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)含量；ELISA法檢測肝組織腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素-8(IL-8)水平、超氧化物歧化酶(SOD)活性，Western blot檢測大鼠肝組織中醌氧化還原酶1 (Nqo1)的表達。結果: 正常組大鼠肝組織切片油紅染色僅見少量分散脂滴, 模型組可見大量紅色脂滴, 藍莓組與異甘草酸鎂組脂滴明顯少于模型組；與藍莓組及異甘草酸鎂組比較, 模型組大鼠血清ALT、AST、TG、TC及肝組織TNF-α、IL-8含量明顯升高(P<0.05)，SOD活性明顯降低(P<0.05)；相對于正常組，藍莓組和異甘草酸鎂組Nqo1蛋白的表達明顯升高(P<0.05)。結論: 藍莓對非酒精性脂肪肝大鼠肝損傷有較好的保護的作用, 其機制可能與上調(diào)肝組織中Nqo1蛋白的表達有關。

[關鍵詞]藍莓； 脂肪肝，非酒精性； 醌氧化還原酶1； 腫瘤壞死因子； 白細胞介素-8

非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種與胰島素抵抗(insulin resistance，IR)、遺傳易感性和代謝紊亂密切相關的氧化應激性肝病，包括非酒精性單純性脂肪肝(nonalcoholic simple fatty liver，NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)及相關肝硬化和肝癌[1-2]。隨著我國生活水平的提高和飲食結構的變化，NAFLD的發(fā)病率有逐漸增加的趨勢[3]，研究認為氧化應激是NAFLD發(fā)病的核心機制[4]。本課題組前期研究已經(jīng)證實，藍莓具有減輕NAFLD大鼠氧化應激損傷的作用[5]。本研究以非酒精性脂肪肝模型為對象，探討藍莓對非酒精性脂肪肝肝組織Nqo1蛋白表達的影響。

1材料與方法

1.1主要試劑及儀器

藍莓(兔眼品種)由貴州省麻江藍莓基地提供。異甘草酸鎂(天晴甘美,H20051942) ，高脂飼料純化型(江蘇南通特洛菲飼料科技有限公司，TP26300) ，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)檢測試劑盒(酶聯(lián)生物, ml002859)，白介素-8(interleukin8, IL-8)檢測試劑盒(酶聯(lián)生物, ml002885)， 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)蛋白活性檢測試劑盒(酶聯(lián)生物, ml016361)，大鼠還原型輔酶/醌氧化還原酶1(NADPH quinone oxidoreductase 1，Nqo1) 一抗(Abcam公司)，兔抗鼠β-actin多克隆抗體(博士德，BA2305)，辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗(上?；蚬こ滩浚珿K500710) ，BCA 蛋白含量檢測試劑盒(Biomiga，PW0104)。全波長酶標儀(BioTec)，全自動生化分析儀(日本ADVIA2400)，1DYCZ-24DN 型電泳儀(北京六一) ；圖像采集系統(tǒng)(OLYMPUS，BX41)。

1.2動物模型建立與分組

雄性SD 大鼠40 只，體質量180～220 g，由貴州醫(yī)科大學動物實驗中心提供[許可證號: SCXK(黔) 2012-0001]，飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學動物實驗中心。40只SD大鼠適應性飼養(yǎng)1 周后隨機分為正常組、藍莓組、異甘草酸鎂組及模型組，每組10 只。除正常組使用正常飼料喂養(yǎng)外，其余各組均用高脂飼料喂養(yǎng)。藍莓組每日固定時間予藍莓原漿15 mL/(kg·d)灌胃[5]，異甘草酸鎂組予異甘草酸鎂溶液15 mL/(kg·d) 灌胃，將原液稀釋至1 g/L后，按體表面積計算劑量相當于成人臨床推薦劑量；正常組和模型組大鼠予相同量的生理鹽水灌胃。各組自由飲食、飲水。8周后處死所有大鼠，處死前禁食禁水12 h，用10%水合氯醛麻醉，股動脈采血，分離血清待用，收集肝臟標本，新鮮肝臟行油紅染色，其余肝組織存入-80 ℃待用。

1.3觀察指標

取新鮮大鼠肝組織制備病理切片，行油紅染色鑒定造模是否成功；全自動生化分析儀測定大鼠血清谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、甘油三酯(triglyceride, TG)、總膽固醇(total cholesterol, TC)含量；ELISA法測定肝組織中TNF-α、IL-8含量及SOD 活性； Western blot 檢測肝組織Nqo1蛋白表達水平，取40 mg肝組織勻漿后加入細胞裂解液，4 ℃離心提取蛋白，BCA試劑盒行蛋白定量，制濃縮膠、分離膠，蛋白質上樣量為80 μg，電泳電壓為120 V，2 h后轉膜，脫脂奶粉封閉，洗膜后加入Nqo1 抗體(1∶1 500)，4 ℃震蕩孵育，過夜后二抗(1∶3 000) 室溫孵育1 h，ECL 發(fā)光液加入條帶上顯影，凝膠成像儀掃描，Quantity One 軟件分析結果；以β-actin表達水平作為內(nèi)參，目標蛋白的表達量以目標蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的對比值表示。

1.4統(tǒng)計學方法

2結果

2.1肝組織脂肪沉積程度

結果顯示，正常組大鼠肝組織僅見少量分散脂滴, 模型組可見大量紅色脂滴, 藍莓組與異甘草酸鎂組大鼠肝組織中的脂滴明顯少于模型組。見圖1。

2.2血清ALT、AST、TG及TC水平

模型組ALT、AST、TG及TC均高于正常組(P<0.05)，藍莓組和異甘草酸鎂組各指標低于模型組(P<0.05)，藍莓組各指標高于異甘草酸鎂組(P<0.05)。見表1。

注: A為正常組，B為藍莓組，C為異甘草酸鎂組，D為模型組圖1　各組大鼠肝組織(油紅，×400)Fig.1　Pathological changes of rat liver in each group detected by oil red O staining

組別n血清ALT(U/L)AST(U/L)TG(mmol/L)TC(mmol/L)正常組1037.25±7.74 75.07±18.60 0.81±0.210.69±0.36藍莓組10 74.60±9.15(1)(2)(3)152.29±17.51(1)(2)(3)1.68±0.16(1)(2)(3)2.35±0.41(1)(2)(3)異甘草酸鎂組1055.42±8.04(2)114.24±17.99(2)1.25±0.24(2)1.51±0.32(2)模型組10 122.17±11.36(1)(3)201.94±20.03(1)(3)2.25±0.26(1)(3)3.24±0.45(1)(3)

(1)與正常組比較,P<0.05;(2)與模型組比較，P<0.05；(3)與異甘草酸鎂組比較，P<0.05

2.3肝組織SOD活性、TNF-α及IL-8含量

模型組大鼠肝組織SOD活性顯著低于正常組，TNF-α、IL-8含量顯著高于正常組(P<0.05)，藍莓組SOD活性高于模型組，TNF-α、IL-8含量顯著低于模型組(P<0.05)。見表2。

2.4肝組織Nqo1表達

模型組大鼠肝組織中Nqo1蛋白水平較正常組高(P>0.05)，藍莓組和異甘草酸鎂組Nqo1蛋白表達量較模型組高(P<0.05)，藍莓組表達較異甘草酸鎂組低(P<0.05)。見圖2。

(1)與正常組比較,P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05圖2　各組大鼠肝組織Nqo1蛋白表達水平Fig.2　The protein expression levels of Nqo1 in rat liver in each group

3討論

藍莓是一種具有很強保健功能食品，具有抗氧化、抗炎癥、抗衰老、降血壓、降血脂、抗癌、延緩骨質疏松及抗菌等作用[6-7]NAFLD作為一種代謝性肝病，其發(fā)病機制與胰島素抵抗、氧化應激、脂質過氧化、細胞凋亡及以上因素發(fā)展所引起的炎癥等密

表2　各組大鼠肝組織TNF-α、IL-8及SOD表達

(1)與正常組比較,P<0.05;(2)與模型組比較，P<0.05；(3)與異甘草酸鎂組比較，P<0.05

切相關[8]，其中氧化應激機制占有重要地位。Liu等[9]用藍莓提取物預防性處理肝細胞，隨后加入油酸，證明藍莓可以減輕油酸誘導的肝細胞脂肪變性。本課題組前期研究已經(jīng)證實，藍莓所具有的抗氧化活性能夠激活沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)及其下游細胞因子，發(fā)揮抗氧化應激作用；還可以通過上調(diào)核因子相關因子2 (Nrf2)的表達，提高肝臟抗氧化能力，從而減輕NAFLD損傷[5,10]。Nqo1是細胞內(nèi)的重要Ⅱ相代謝酶，該酶能夠以NADPH為電子供體，參與包括輔酶q和醌類等多種物質的還原反應,從而與氧化應激引起的細胞損害有關[11]。醌類的還原有利于減少活性氧簇的產(chǎn)生，從而減輕NAFLD狀態(tài)下的氧化應激損傷。Nqo1的作用受到Nrf2/抗氧化反應元件(ARE)通路的調(diào)控[12]。Nrf2/ARE 通路是重要的內(nèi)源性抗氧化應激通路，其多種下游靶基因都與抗氧化應激和抗炎癥反應有關[12-13]。有研究表明， Nqo1的表達水平主要受到 Nrf2的調(diào)節(jié)[14]。Wang等[15]發(fā)現(xiàn)藍莓可以通過上調(diào)Nrf2的表達進而上調(diào)Nqo1的表達，從而增強小鼠肝臟的抗氧化能力。除以上所述細胞代謝異常的氧化應激損傷之外，炎癥的發(fā)展亦可以加重氧化損傷。由于肝細胞的嚴重脂肪變性和壞死，受損肝細胞和肝巨噬細胞釋放出一些炎癥因子如TNF-α、IL-8等，進一步引起中性粒細胞和淋巴細胞等炎癥細胞浸潤。這些炎癥細胞也釋放出O2-、OH及O2等物質[16]，進一步加重細胞膜等結構的損傷，加快疾病的發(fā)展。

本實驗采用高脂飲食誘導的大鼠非酒精性脂肪肝模型，對比藍莓干預后TNF-α和IL-8含量的變化，研究藍莓在對抗肝臟炎癥方面的作用；比較SOD活性和Nqo1蛋白表達量在各組大鼠肝臟變化的情況，探討藍莓的抗氧化活性防治NAFLD氧化應激損傷的機制。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠肝組織SOD活性顯著低于正常組，TNF-α、IL-8含量顯著高于正常組。同時免疫印跡法提示肝組織Nqo1表達較正常組升高，但差異并無統(tǒng)計學意義。據(jù)此可以推測，在大鼠NAFLD發(fā)生過程中，脂肪等物質代謝障礙引起ROS、醌類等氧化活性物質異常積累，SOD等還原性物質大量消耗，使肝細胞發(fā)生嚴重脂肪變性、壞死和凋亡，并進一步引起肝臟炎癥，炎癥的發(fā)展又反過來加重了氧化應激損傷，最終導致了NAFLD的發(fā)生。藍莓組大鼠血清ALT、AST、TG及TC水平顯著低于模型組， SOD活性顯著高于模型組，TNF-α、IL-8含量顯著低于模型組，病理組織學檢查發(fā)現(xiàn)其肝細胞脂質沉積顯著減輕，與異甘草酸鎂組接近；表明藍莓可改善肝功能，減輕肝臟脂肪變，減少炎癥因子的釋放，對NAFLD大鼠的肝損傷具有減輕作用。藍莓組Nqo1蛋白表達水平較模型組和正常組高，說明藍莓具有上調(diào)Nqo1蛋白表達，從而促進輔酶Q和醌類物質的轉化，減輕肝臟氧化應激損傷的作用，藍莓對它的調(diào)控方式可能是通過Nrf2/ARE通路進行間接調(diào)控。推測藍莓減輕NAFLD大鼠肝臟損傷的機制，可能與上調(diào)Nqo1蛋白表達，同時減輕肝臟炎癥有關。

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(2015-12-05收稿，2016-02-10修回)

中文編輯： 吳昌學； 英文編輯： 劉華

Effect of Blueberry Compound on Hepatocyte Expression of Nqo1 in Rats Model of Non-alcoholic Fatty Liver Disease

ZHAO Danbo1， REN Tingting2， CHENG Mingliang1， YU Ping1

(1.DepartmentofInfectiousDiseases,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the protection effect of blueberry on rats with non-alcoholic fatty liver disease and its mechanism. Methods: Forty healthy SD rats were randomly divided into normal control group, blueberry group, magnesium isoglycyrrhizinate group and model group. The rats in normal control group were given normal diet, while other groups were all given high fat diet. Blueberry group and magnesium isoglycyrrhizinate group were given blueberry juice by intragastric administration while normal group and model group were given equivalent volume of physiological saline by intragastric administration at the same time per day．At the end of 8(th) week, all rats were sacrificed. Pathological changes in the hepatic tissue were observed by Oil-Red staining. The contents of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), triglyceride (TG) and total cholesterol (TC) in serum were detected by automatic biochemical analyzer. The contents of TNF-α, IL-8 and SOD activity in hepatic tissue were detected by ELISA. The expression of Nqo1 in liver tissue was detected by Western blot. Results: The Oil-Red staining result showed that only a little dispersed lipid droplet could be seen in normal group, blueberry group and magnesium isoglycyrrhizinate group while a lot of dispersed lipid droplet in model group. Compared with blueberry group and magnesium isoglycyrrhizinate group, the contents of serum ALT, AST, TG and TC increased significantly, and the contents of TNF-α and IL-8 in heptic tissue inceased significantly (P<0.05) while SOD activity decreased significantly (P<0.05). Compared with normal group, the protein expression levels of Nqo1 in blueberry group and magnesium isoglycyrrhizinate group increased significantly (P<0.05). Conclusion: Blueberry can play a protective role in liver injury of non-alcoholic fatty liver of rats and the mechanism might be associated with upregulating the expression of Nqo1 in hepatic tissue.

[Key words]blueberry; fatty liver，non-alcoholic; quinone oxidoreductase 1; tumor necrosis factor; interleukin-8

[中圖分類號]R363.1； R575.5

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)03-0276-04

*[基金項目]教育部博士點經(jīng)費基金資助項目(No. M2012-59)

**通信作者 E-mail:mlcheng@yeah.com

網(wǎng)絡出版時間：2016-03-17網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160317.1054.044.html