趙大尉， 謝　甦， 張　意， 管志敏， 賀　昀, 張雲(yún)杰

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 研究生院， 貴州 貴陽　550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 中醫(yī)科， 貴州 貴陽　550004； 3.天津市靜海區(qū)陳官屯醫(yī)院 中醫(yī)科， 天津 靜?！?01600)

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膈俞穴注射4T1細(xì)胞構(gòu)建小鼠乳腺癌模型的實(shí)驗(yàn)研究*

趙大尉1**， 謝甦2***， 張意3， 管志敏1， 賀昀1, 張雲(yún)杰1

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 研究生院， 貴州 貴陽550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 中醫(yī)科， 貴州 貴陽550004； 3.天津市靜海區(qū)陳官屯醫(yī)院 中醫(yī)科， 天津 靜海301600)

[摘要]目的： 探討膈俞穴注射乳腺癌4T1細(xì)胞構(gòu)建小鼠乳腺癌模型的可行性。方法： 清潔級4～6周齡雌性BALB/c小鼠16只，隨機(jī)分為膈俞穴組和右肩胛組各8只，膈俞穴組將小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞懸液接種于BALB/c小鼠左側(cè)膈俞穴，右肩胛組接種于右側(cè)肩胛部作為對照，觀察兩組小鼠成模時(shí)間、成瘤率、小鼠的遠(yuǎn)期存活率以及腫瘤生長曲線。結(jié)果： 膈俞穴組小鼠的成瘤時(shí)間快于右肩胛組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；腫瘤生長曲線顯示膈俞穴組腫瘤生長速度明顯高于右肩胛組，且后期兩組之間的差距越來越明顯(P<0.05)，但兩組成瘤率及遠(yuǎn)期存活率均無差異。結(jié)論： 膈俞穴注射乳腺癌4T1 細(xì)胞可成功復(fù)制小鼠乳腺癌模型，且成模時(shí)間短。

[關(guān)鍵詞]膈俞穴； 乳腺腫瘤； 4T1 細(xì)胞； 模型，動物； 小鼠

雖然我國女性乳腺癌的發(fā)病率和死亡率在世界范圍處于中低水平，但是乳腺癌仍是我國女性最常見的癌癥之一[1]，為深入研究本病的防治，建立高效、便捷、可靠的動物模型十分關(guān)鍵。在中醫(yī)針灸理論中，膈俞穴為八會穴的血會，此處內(nèi)應(yīng)膈膜，膈膜之上有心，心主血；膈膜之下有肝，肝藏血。此外，手太陰肺經(jīng)“上膈”，足太陰脾經(jīng)“上貫膈”。膈膜與主血四臟均關(guān)系密切，可以調(diào)理氣血，故為血會。因膈俞穴氣血旺盛，利于乳腺癌4T1細(xì)胞的生長，故本實(shí)驗(yàn)選用此穴作為構(gòu)建動物乳腺癌模型的穴位。

1材料與方法

1.1材料

16只清潔級4～6周齡雌性BALB/c小鼠由貴州醫(yī)科大學(xué)動物中心購入，體重(20±2)g；4T1乳腺癌細(xì)胞株購自中科院細(xì)胞庫，1640培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司，胎牛血清及胰蛋白酶購自北京索來寶公司，青霉素及鏈霉素為華北制藥集團(tuán)公司產(chǎn)品；超凈臺購自美國BIOLOGICAL公司，恒溫水浴箱(HH-W420)由江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠生產(chǎn)，CO2恒溫培養(yǎng)箱購自TC-2323型美國SHELDON公司，-80 ℃超低溫冰箱由日本SANYO公司生產(chǎn)、臺式離心機(jī)(Anke TDL-40B)由上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)。

1.2乳腺癌4T1細(xì)胞懸液的制備

傳代培養(yǎng)小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞，收集處于對數(shù)生長期的4T1細(xì)胞，用PBS潤洗2次，吸棄PBS后加入適量全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度，制備成1×107/mL的4T1細(xì)胞懸液備用。

1.3動物模型的建立

16只BALB/c小鼠予以正常飲食適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為膈俞穴組和右肩胛組，每組8只，膈俞穴組將4T1 細(xì)胞懸液注射于BALB/c 小鼠左側(cè)膈俞穴(小鼠膈俞穴定位第7胸椎下兩旁肋間)[2]，右肩胛組參照文獻(xiàn)[3]將4T1細(xì)胞懸液注射于BALB/c 小鼠右側(cè)肩胛部處。

1.4觀察指標(biāo)

注射4T1 細(xì)胞后，每天觀察小鼠生活飲食及接種部位瘤塊的生長情況，包括瘤塊出現(xiàn)時(shí)間、瘤塊大小、成瘤率和遠(yuǎn)期(30 d)存活率。每隔5 d用游標(biāo)卡尺測量瘤塊的長徑(a)和短徑(b)，并根據(jù)V=ab2/2計(jì)算瘤塊體積[4]，繪制生長曲線。第30 天時(shí)脫頸處死兩組小鼠，取出腫瘤組織，用帶表游標(biāo)卡尺測量腫瘤長短徑，送貴州醫(yī)科大學(xué)附院病理科HE染色，觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 17. 0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1腫瘤生長狀況和病理檢查結(jié)果

膈俞穴組小鼠接種4T1細(xì)胞2～6 d后接種部位均出現(xiàn)腫塊，右肩胛組于4～8 d后長出腫塊，兩組腫塊均質(zhì)硬、增長迅速、活動度不高，10 d后兩組小鼠中均有部分出現(xiàn)瘤塊破潰現(xiàn)象。接種后第30 天時(shí)脫頸處死小鼠，解剖可見瘤體呈粉白色，大部分出現(xiàn)胸腔、腹腔或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移且與周圍組織高度粘連；病理檢查顯示腫瘤細(xì)胞多呈圓形，核漿比率大，核仁和染色質(zhì)染色深，細(xì)胞分裂活躍，細(xì)胞排列無序，癌細(xì)胞呈實(shí)性片狀彌漫性分布，少數(shù)呈腺腔樣，浸入周圍組織及橫紋肌，部分伴壞死，見圖1。

2.2成瘤時(shí)間、成瘤率及存活時(shí)間

膈俞穴組小鼠的成瘤時(shí)間、遠(yuǎn)期存活率均優(yōu)于右肩胛組，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1　小鼠膈俞穴或右肩胛接種乳腺癌

(1)與對照組比較，P<0.05

2.3移植瘤的生長曲線

膈俞穴組平均腫瘤體積從第5天開始到第30天均明顯高于右肩胛組，且后期兩組之間的差距越來越明顯，見圖2。

3討論

圖1　膈俞穴或右肩胛接種乳腺癌4T1細(xì)胞30 d時(shí)的腫瘤組織(HE，×100)Fig.1　Tumor tissues in experimental group and control group

圖2　膈俞穴組和右肩胛組瘤體生長曲線Fig.2　Comparison of tumor growth curves between experimental group and control group

目前，比較成熟的乳腺癌動物模型復(fù)制方法有：(1)自發(fā)型，即采取近交繁殖的小鼠，培育到一定年齡則自發(fā)出現(xiàn)乳腺癌；(2)誘發(fā)型，多采用有致癌作用的化學(xué)物質(zhì)，經(jīng)不同方式作用于實(shí)驗(yàn)動物，誘使其發(fā)生乳腺癌；(3)移植型，有同種和異種、原位和異位的區(qū)別，但都是將腫瘤組織或細(xì)胞種植于實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)；(4)轉(zhuǎn)基因型，即將特定的基因?qū)雱游矬w內(nèi)，并使其在宿主體內(nèi)表達(dá)、遺傳[5-6]。本實(shí)驗(yàn)采用了移植型復(fù)制方法。膈俞穴是八會穴中的血會，為全身氣血匯聚之處。《類經(jīng)圖翼》中提到“足太陽穴,谷氣由隔達(dá)于上焦,化精微為血之處,故曰血會?！痹?jīng)有人檢索了大量文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)膈俞穴適應(yīng)癥廣泛，長于治療血證，有活血化瘀、通絡(luò)止痛、養(yǎng)血止血的作用[7]。歷代醫(yī)家對膈俞穴也有獨(dú)到的論述，如元代醫(yī)家滑伯仁云:“膈俞是太陽脈氣所發(fā)也,太陽多血,又血乃脈之象”。清代醫(yī)家陳修園曰:“諸經(jīng)之血,皆從膈膜上下,又心主血,肝藏血,心位于膈上。肝位膈下,交通于膈膜,故血會于膈膜也”[8]。氣血是人體內(nèi)的精微物質(zhì)，是生命物質(zhì)的本源，因而有形之邪在體內(nèi)得以生長也離不開氣血的滋養(yǎng)。另外，機(jī)體各臟腑的正常運(yùn)行全賴氣機(jī)健運(yùn)、營血滋養(yǎng)，外來邪氣會消耗機(jī)體的氣血，若邪氣占用大部分氣血，將導(dǎo)致正氣更虛，機(jī)體會出現(xiàn)邪盛正衰。如《醫(yī)宗必讀》中提到“積之成也,正氣不足,而后邪氣踞之”[9]。金代醫(yī)家張?jiān)卦凇痘罘C(jī)要》中曰“壯人無積,虛人則有之,脾胃虛弱,氣血兩衰,四時(shí)有感,皆能成積”[10]。故本實(shí)驗(yàn)選取膈俞穴注射小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞懸液，一方面是將乳腺癌細(xì)胞種植于氣血旺盛之處，易于腫瘤細(xì)胞在動物體內(nèi)增殖生長；另一方面，腫瘤耗損氣血，造成機(jī)體正氣虧虛，防御功能減弱，從而更易于腫瘤的生長。另外，膈俞穴對應(yīng)膈肌部位，在西醫(yī)解剖學(xué)中認(rèn)為，膈肌的上方是肺，肺通過肺動、靜脈完成肺循環(huán)，從而完成血液中氣體的交換；其下方是胃腸，此處完成營養(yǎng)物質(zhì)與代謝產(chǎn)物的交換。血液在隔膜上下的兩次新陳代謝構(gòu)成了血液整體的以舊換新,加之隔膜主動脈與腔靜脈裂孔的存在,使隔俞位于隔膜位置對于血的運(yùn)化具有了一定意義[11]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，膈俞穴組成瘤時(shí)間明顯早于右肩胛組，且病理切片顯示為癌變，說明膈俞穴注射4T1細(xì)胞確實(shí)可以復(fù)制小鼠乳腺癌模型，并可縮短成膜時(shí)間，對小鼠遠(yuǎn)期存活率無影響。實(shí)驗(yàn)過程中，選擇膈俞穴注射小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞懸液小鼠容易固定，一人即可完成操作，而傳統(tǒng)的注射于右側(cè)肩胛部，因部位接近頭部，為防止咬傷需要一人固定小鼠，一人注射，不方便操作。且注射于肩胛部，腫瘤長大后會致頸部、耳背部均為腫瘤，此時(shí)抓取老鼠會刺激腫瘤產(chǎn)生疼痛，增加了抓取老鼠的難度，而注射于膈俞穴則無論腫瘤大小，均可輕松抓取。此外，在觀察腫瘤、測量腫瘤大小時(shí)，膈俞穴也較肩胛部易于觀察和測量，降低了測量誤差。實(shí)驗(yàn)中，膈俞穴處腫瘤生長迅速，腫瘤大小適中，可以縮短造模時(shí)間，對遠(yuǎn)期存活率影響不大，實(shí)驗(yàn)小鼠可以存活至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。實(shí)驗(yàn)的不足在于實(shí)驗(yàn)樣本量較少，還需要后續(xù)大樣本量的實(shí)驗(yàn)作為支撐。

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(2015-12-09收稿，2016-02-21修回)

中文編輯： 戚璐； 英文編輯： 劉華

Experimental Study on Construction of Mice Breast Cancer Model By Geshu Acupoint Injection with 4T1 cells

ZHAO Dawei1， XIE Su2， ZHANG Yi3， GUAN Zhimin1， HE Yun1, ZHANG Yunjie1

(1.GraduateSchool,GuizhouMedicalUniversity，Guiyang550004,Guizhou,China; 2.DepartmentofTraditionalChineseMedicine,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.DepartmentofTraditionalChineseMedicine,theChenguantunHospitalinJinghaiDistrict,Tianjin301600,China)

[Abstract]Objective: To explore the feasibility of mouse breast cancer model construction by Geshu acupoint injection of breast cancer 4T1 cells. Methods: Sixty female SPF BALB/c mice of 4 to 6 weeks old were randomly divided into Geshu group and Shoulder blade group, 8 mice in each group. Geshu group was inoculated with breast cancer 4T1 cells suspension in left Geshu acupoint while Shoulder blade group inoculated with breast cancer 4T1 cells suspension in right shoulder blade. Tumor formation time, tumor formation rate, tumor growth curve and forward survival rate were compared between two groups. Results: Tumor formation time in Geshu group was significantly shorter than that of Shoulder blade group(P<0.05). The tumor growth curve showed that tumor growth rate in Geshu group was significantly higher that that of Shoulder blade group, and the difference in tumor growth rate between the two groups was becoming more and more obvious(P<0.05). Howerver, there was no difference in the tumor formation rate and the forward survival rate. Conclusion: GeShu acupoint injection of breast cancer 4T1 cells can successfully construct mouse breast cancer model in relatively short time.

[Key words]Geshu acupoint; breast cancer; 4T1 cells; model, animal; mice

[中圖分類號]R73-351

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)03-0304-03

*[基金項(xiàng)目]貴州省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究課題基金(QZYY-2015-155)

**貴州醫(yī)科大學(xué)2013級碩士研究生

***通信作者 E-mail:972254428@qq.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-03-17網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160317.1007.004.html