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1.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院急診科，江西　贛州　341000；2. 贛州市人民醫(yī)院急診科，江西　贛州　341000

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蟲草菌粉對(duì)急性百草枯中毒大鼠肺損傷的治療及相關(guān)機(jī)制

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1.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院急診科，江西贛州341000；2. 贛州市人民醫(yī)院急診科，江西贛州341000

【摘要】目的：觀察蟲草菌粉對(duì)急性百草枯中毒大鼠肺損傷的治療作用及相關(guān)機(jī)制。方法：選用健康成年SD大鼠112只(雌雄各半)，隨機(jī)分為A、B、C、D組。A組(健康對(duì)照組)7只，B組(單純?nèi)径窘M)35只，C組(蟲草菌粉治療組)35只，D組(蟲草菌粉對(duì)照組)35只。B、C組給予一次PQ 20mg/Kg腹腔注射，A、D組給予一次等量生理鹽水腹腔注射。C、D組每日給予蟲草菌粉5g/kg灌胃。觀察4組大鼠狀況、病理學(xué)變化與相關(guān)指標(biāo)水平變化。結(jié)果：A、C、D組大鼠各時(shí)間點(diǎn)精神狀態(tài)、活動(dòng)度均表現(xiàn)良好，呼吸平穩(wěn)；C組與A、D組比較。大鼠狀況與病理學(xué)變化明顯，各指標(biāo)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)蟲草菌粉灌胃，C組與B組比較癥狀明顯改善；且C組大鼠肺組織損傷程度、血清中MDA、SOD、GSH-Px水平，C組肺濕/干重比值(W/D)、肺損傷肺組織中α1-AT水平均顯著優(yōu)于B組(P<0.05)。結(jié)論：蟲草菌粉對(duì)PQ中毒引起的急性肺損傷有較好的治療作用，可清除氧自由基，提高機(jī)體抗氧化損傷、抑制脂質(zhì)過氧化，可促進(jìn)α1-AT表達(dá)，減輕PQ中毒引起的肺組織損傷。

【關(guān)鍵詞】百草枯中毒；蟲草菌粉；肺損傷

百草枯(PQ)有著良好的除草效果，且使用范圍廣泛，但中毒死亡率極高，對(duì)醫(yī)療工作者提出了巨大的挑戰(zhàn)。PQ中毒致死量小，肺組織中毒物濃度最高，因此肺損傷最為嚴(yán)重，患者多死于呼吸窘迫綜合征，死亡率可高達(dá)85%～95%[1]。目前治療百草枯中毒的中成藥還比較少。蟲草菌粉是從新鮮冬蟲夏草中分離得到菌絲體，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)所得菌絲體的干燥粉末，開展蟲草菌粉對(duì)急性百草枯中毒大鼠肺損傷研究可為開拓臨床應(yīng)用范圍和指導(dǎo)臨床實(shí)踐、增加適應(yīng)癥，提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)[2]。實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制PQ急性中毒大鼠模型，觀察蟲草菌粉對(duì)PQ中毒所致急性肺損傷的治療作用及機(jī)制，以便采取中西醫(yī)結(jié)合以及其他綜合治療措施，延長(zhǎng)患者壽命。

1材料與方法

1.1材料與試劑健康成年SD大鼠112只(雌雄各半)，體質(zhì)量250~300g，由贛南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。20%百枯草原液(先正達(dá)(中國(guó))投資有限公司)；蟲草菌粉(批號(hào)：040801，江西金水寶制藥有限公司)。MDA試劑盒(批號(hào)：20101022)、SOD試劑盒(批號(hào)：20101025)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(批號(hào)：20101025)均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)蛋白抗體、免疫組化試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2分組及給藥選用健康成年SD大鼠112只，隨機(jī)分為A、B、C、D組。A組：健康對(duì)照組7只；B組：?jiǎn)渭內(nèi)径窘M35只；C組：蟲草菌粉治療組35只；D組：蟲草菌粉對(duì)照組35只。B、C組給予一次PQ20mg/Kg腹腔注射，A、D組給予一次等量生理鹽水腹腔注射。C、D組每日給予蟲草菌粉5g/kg灌胃，A、B組每日給予等量生理鹽水灌胃。

1.3標(biāo)本采集與檢測(cè)B組、C組分別于染毒后1d、3d、7d、14d、21d、28d、35d各取5只大鼠心臟取血處死，留取血標(biāo)本，測(cè)定丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)。A組、D組也在相同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定以上指標(biāo)，測(cè)定方法按試劑盒說明進(jìn)行。同時(shí)，以上各組均取大鼠整個(gè)左肺，用濾紙吸干血漬，分析天平稱重后放入80℃恒溫烤箱烘烤24h，計(jì)算肺濕/干重比值(W/D)，右肺前葉組織制備病理切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色(HE)，在400倍光鏡下進(jìn)行病理觀察。應(yīng)用免疫組化法，PQ中毒急性肺損傷肺組織中α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)的表達(dá)(肺組織石蠟切片免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)α1-AT蛋白表達(dá)，按試劑盒說明書操作)。采樣方法：心臟取血處死大鼠，采血收集血樣并取出左、右肺，采血注射器及試管均在實(shí)驗(yàn)前用500u/ml肝素濕潤(rùn)。α1-AT免疫組化染色陽(yáng)性切片與40HP物鏡下挑選10個(gè)視野觀測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞胞漿平均吸光度(OD)，以其單位面積相對(duì)含量反應(yīng)染色強(qiáng)度。

2結(jié)果

2.1一般狀況A組與D組大鼠精神狀態(tài)良好，活動(dòng)如常，能夠自由進(jìn)食飲水。B組大鼠在腹腔注射PQ 2h開始出現(xiàn)精神差，萎靡不振，伴有不同程度的毛發(fā)松散、瞇眼、步態(tài)蹣跚與拱背。1d后出現(xiàn)四肢末端、口唇紫紺，呼吸加快加深，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而加重；3~7d后出現(xiàn)觸之反應(yīng)差，靜伏，呼吸急促或點(diǎn)頭樣呼吸，甚至呼吸窘迫情況，全身出現(xiàn)明顯紫紺；14d后存活的大鼠癥狀開始逐漸減輕，并恢復(fù)正常；21d后存活大鼠再次出現(xiàn)呼吸頻率加快、氣促，個(gè)別大鼠死亡前出現(xiàn)呼吸困難、紫紺等缺氧癥狀，其余無(wú)明顯紫紺。C組與B組比較，大鼠各時(shí)間點(diǎn)精神狀態(tài)、活動(dòng)度均表現(xiàn)良好，呼吸平穩(wěn)，癥狀明顯改善。

2.2大鼠肺組織病理學(xué)變化A組與D組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺臟表面呈粉紅色，質(zhì)軟富有彈性，表面光滑。B組大鼠1d肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔可見少量炎性細(xì)胞滲出，表面僅見散在點(diǎn)狀出血；3d肺泡結(jié)構(gòu)可辨認(rèn)，肺泡壁局部增厚，肺泡腔大量炎性細(xì)胞滲出；7d肺組織中表現(xiàn)出巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺泡腔有透明膜形成，充滿水腫液，肺泡壁斷裂，嚴(yán)重的有彌漫性肺出血，甚至結(jié)構(gòu)消失，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，肺組織損傷程度逐漸加重；14d出現(xiàn)部分肺泡間隔纖維性增厚，肺泡結(jié)構(gòu)不清，肺泡腔內(nèi)充滿炎性細(xì)胞滲出，但較之前減少，可見膠原纖維增生；21d大部分肺泡明顯塌陷，形成纖維細(xì)胞進(jìn)一步增多；28d肺明顯形成纖維化，肺泡腔、肺間質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且生成大量纖維細(xì)胞；35d大鼠肺纖維化病灶數(shù)明顯增多。蟲草菌粉干預(yù)的C組大鼠肺組織損傷比B組顯著更輕。

2.3血清中MDA、SOD、GSH-Px測(cè)定比較 各時(shí)間點(diǎn)四組大鼠血清中MDA、SOD、GSH-Px水平見表1-3。

表1血清MDA含量

時(shí)間A組B組C組D組1d5.21±0.158.23±0.26**##5.96±0.24**##△5.27±0.243d5.35±0.169.69±0.3**##6.40±0.33**##△5.24±0.187d5.34±0.1411.09±0.23**##6.52±0.26**##△5.26±0.1514d5.26±0.1710.25±0.27**##6.48±0.29**##△5.27±0.1521d5.24±0.189.67±0.32**##6.37±0.31**##△△5.25±0.1428d5.33±0.149.31±0.33**##6.24±0.27**##△△5.32±0.1635d5.25±0.168.92±0.34**##6.28±0.23**##△△5.24±0.18

注：與A組比較，**P<0.01，與D組比較，##P<0.01；與B組比較，△P<0.05，△△P<0.01。下同。

表2血清SOD含量

時(shí)間A組B組C組D組)1d360.2±15.8293.4±16.4**##341.3±12.6**##△△361.2±15.63d362.3±16.2269.5±18.5**##333.2±17.8**##△△362.6±16.47d363.6±16.9244.3±17.4**##325.6±14.2**##△△363.3±16.314d362.4±15.8255.2±18.3**##329.2±16.7**##△△362.8±15.521d363.0±16.4267.3±16.4**##326.3±15.3**##△△362.9±16.828d361.5±17.1262.5±17.3**##328.5±16.2**##△△361.7±17.435d363.2±16.7260.2±16.2**##330.5±13.2**##△△362.7±16.9

表3血清GSH-Px含量

時(shí)間A組B組C組D組1d243.2±16.3196.2±14.4**##207.3±11.6**##△△241.5±16.13d246.1±16.4165.2±15.2**##202.2±12.7**##△△242.3±16.67d251.9±15.8159.2±14.1**##198.3±14.3**##△△241.3±15.714d246.7±16.4148.3±13.6**##204.7±14.2**##△△244.3±16.821d242.3±16.5129.6±15.6**##228.4±13.9**##△△246.8±16.328d244.8±15.4111.4±11.3**##232.5±14.2**##△△245.9±16.235d245.2±16.0109.2±12.1**##237.5±14.6**##△△243.4±15.9

2.4大鼠肺濕/干重比值(W/D)、肺損傷肺組織中α1-AT水平A組W/D值：(2.44±0.16)，B組W/D值：(5.05±1.31)，C組W/D值：(3.87±1.00)，D組W/D值：(2.68±0.13)。B組與C組W/D值均顯著與A組與D組(P<0.01)，且C組W/D值顯著低于B組(P<0.01)。

2.5四組大鼠肺損傷組織中α1-AT水平對(duì)比對(duì)比觀察四組大鼠肺損傷組織中α1-AT水平。見表4。

表4肺組織中α1-AT OD水平

時(shí)間A組B組C組D組1d0.49±0.020.36±0.04**##0.36±0.03**##0.47±0.023d0.63±0.030.42±0.02**##0.54±0.02*#△△0.61±0027d0.43±0.030.24±0.03*#0.33±0.02*#△△0.44±0.0314d0.47±0.030.17±0.05**##0.32±0.02△△0.49±0.0321d0.43±0.020.13±0.02**##0.38±0.05△△0.42±0.0228d0.47±0.020.12±0.01**##0.41±0.00△△0.48±00335d0.45±0030.11±0.05**##0.39±0.02*#△△0.47±0.02

注：與A組比較，**P<0.01，*P<0.05；與D組比較，##P<0.01，#P<0.05；與B組比較，△△P<0.01。同組不同時(shí)間點(diǎn)單因素方差分析，四組F值：1.92，9.97，6.52，1.89；P值：0.836，0.003，0.011,0.857。

3討論

PQ是一種高效能的非選擇性接觸型除草劑，對(duì)人畜具有很強(qiáng)毒性，贛南地區(qū)百草枯在農(nóng)村應(yīng)用廣泛，臨床工作中PQ中毒患者屢見不鮮。肺是主要靶器官，PQ中毒可導(dǎo)致“PQ肺”，早期表現(xiàn)為急性肺損傷(ALI)或急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，后期出現(xiàn)肺泡內(nèi)和肺間質(zhì)纖維化，是PQ中毒致死的主要原因，其中單純因肺部損傷死亡所占的比例達(dá)50%～70%[3]。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠在腹腔注射PQ 2h開始出現(xiàn)精神差，萎靡不振，伴有不同程度的毛發(fā)松散、瞇眼、步態(tài)蹣跚與拱背。1d后出現(xiàn)四肢末端、口唇紫紺，呼吸加快加深，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而加重；3d后出現(xiàn)觸之反應(yīng)差，靜伏，呼吸急促，甚至呼吸窘迫情況；7d與14d，表現(xiàn)為為急性肺損傷；21~35d大鼠急性損傷基本緩解，同時(shí)現(xiàn)肺纖維化。C組與B組比較，大鼠各時(shí)間點(diǎn)精神狀態(tài)、活動(dòng)度均表現(xiàn)良好，呼吸平穩(wěn)，癥狀明顯改善；而經(jīng)組織病理觀察，大鼠PQ中毒后肺組織中表現(xiàn)出巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺泡腔有透明膜形成，充滿水腫液，肺泡壁斷裂，嚴(yán)重的有彌漫性肺出血，甚至結(jié)構(gòu)消失，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，肺組織損傷程度逐漸加重。

PQ中毒所致的急性肺損傷目前無(wú)特效解毒藥物，研究主要在氧自由基損傷方面展開，抗氧化劑維生素C、維生素E、色甘酸鈉、還原型谷胱甘肽都曾經(jīng)用于治療PQ中毒急性肺損傷[4]，但效果都不確切。研究表明[5]，蟲草菌粉在肺組織炎性及纖維化疾病中有一定的治療作用。超氧化物歧化酶(SOD)與谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)廣泛存在于需氧物體，均為構(gòu)成肺內(nèi)抗脂質(zhì)過氧化酶性保護(hù)系統(tǒng)的主要酶，是體內(nèi)最重要的自由基清除劑，其活性間接反映了機(jī)體清除自由基的能力。丙二醛(MDA)是機(jī)體內(nèi)氧自由基代謝過程中產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，反映了機(jī)體脂質(zhì)過氧化自由基的存在與過氧化反應(yīng)的程度[4]。PQ進(jìn)入體內(nèi)后，經(jīng)自由基損傷作用造成肺組織氧化性損傷，因此對(duì)SOD、GSH-Px活性、MDA濃度的變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)能夠反映機(jī)體清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化損傷的能力[4-5]。研究結(jié)果表明，PQ中毒大鼠血清的SOD、GSH-Px活性顯著下降，MDA濃度顯著升高，該改變可能與PQ在體內(nèi)代謝中生成活性氧自由基過程有關(guān)，在PQ進(jìn)入體內(nèi)后先產(chǎn)生氧離子，在SOD的作用下形成H2O2，中毒早期血漿中SOD活力顯著下降，而中毒中晚期SOD活力稍有升高。GSH-Px活性隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈顯著下降，可能與PQ中毒后期H2O2較多有關(guān)[6]，迅速形成的大量的OH-將大量消耗GSH-Px。給予PQ中毒大鼠以蟲草菌粉治療，血清中MDA含量明顯下降，而SOD活性明顯升高，結(jié)果提示蟲草菌粉可通過清除氧自由基，提高機(jī)體抗氧化損傷、抑制脂質(zhì)過氧化，達(dá)到PQ對(duì)肺組織損傷的作用。另外，研究發(fā)現(xiàn)，在急性肺損傷模型中，內(nèi)毒素組α1-AT 活性明顯低于對(duì)照組，可能因急性肺損傷造成彈性蛋白酶、胰蛋白酶大量釋放，造成蛋白酶與抑制劑比例失衡，ARDS患者注射α1-AT抑制彈性蛋白酶的活性，可減輕內(nèi)毒素引起的肺組織損傷[6]。本研究結(jié)果表明，百草枯中毒大鼠血清肺組織中α1-AT水平在中毒7d后顯著下降，而采用蟲草菌粉可促進(jìn)α1-AT表達(dá)，減輕PQ中毒引起的肺組織損傷。

綜上所述，蟲草菌粉在PQ急性中毒中有較好的治療作用，治療作用與減輕自由基損傷，促進(jìn)α1-AT表達(dá)有關(guān)。

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(收稿日期：2015.12.25)

【中圖分類號(hào)】R595.4

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號(hào)】1007-8517(2016)05-0081-03

作者簡(jiǎn)介：張?jiān)婈?1983-)，男，江西贛州人，主治醫(yī)師。