袁　安　郭亞惠　吳小波　黃　曉　廖春華

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所，南昌330045)

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飼糧蛋白質(zhì)水平對意大利蜜蜂歸巢能力及記憶相關(guān)基因表達(dá)的影響

袁安郭亞惠吳小波*黃曉廖春華

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所，南昌330045)

摘要：本試驗(yàn)旨在研究飼糧蛋白質(zhì)水平對意大利蜜蜂歸巢能力及記憶相關(guān)基因表達(dá)的影響。選擇9群群勢相當(dāng)?shù)谋镜匾獯罄鄯?，隨機(jī)分為3組，每組3群。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組分別飼喂蛋白質(zhì)水平為15%、25%、35%的試驗(yàn)飼糧。飼喂45 d后，測定采集蜂分別在1 000、2 000 m處的回歸率及不同日齡(剛出房、10日齡、20日齡)工蜂3個(gè)記憶相關(guān)基因[谷氨酸受體A型基因(GluRA)、N-甲基-D-天冬氨酸受體1型基因(Nmdar1)、酪胺受體1型基因(Tyr1)]的表達(dá)情況。結(jié)果表明：Ⅱ組和Ⅲ組蜜蜂在1 000、2 000 m處的回歸率均顯著高于Ⅰ組(P<0.05)，但Ⅱ組與Ⅲ組之間差異不顯著(P>0.05)；Ⅲ組10和20日齡工蜂的GluRA相對表達(dá)量顯著高于Ⅱ組和Ⅰ組(P<0.05)，且Ⅱ組工蜂的GluRA相對表達(dá)量也顯著高于Ⅰ組(P<0.05)；Ⅱ組和Ⅲ組10和20日齡工蜂的Nmdar1相對表達(dá)量顯著高于Ⅰ組(P<0.05)，但Ⅱ組與Ⅲ組之間差異不顯著(P>0.05)；Ⅱ組和Ⅲ組10日齡工蜂的Tyr1相對表達(dá)量顯著高于Ⅰ組(P<0.05)，但Ⅱ組與Ⅲ組之間差異不顯著(P>0.05)；各試驗(yàn)組剛出房工蜂的GluRA、Nmdar1、Tyr1以及20日齡工蜂的Tyr1相對表達(dá)量差異均不顯著(P>0.05)。由此得出，飼糧蛋白質(zhì)水平過低會影響意大利蜜蜂的歸巢能力及記憶相關(guān)基因的表達(dá)。

關(guān)鍵詞：意大利蜜蜂；蛋白質(zhì)水平；回歸率；記憶基因

蜜蜂是一種典型的社會性經(jīng)濟(jì)昆蟲，屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda)，昆蟲綱(Insecta)，膜翅目(Hymenoptera)，蜜蜂總科(Apoidea)，蜜蜂科(Apidae)，蜜蜂屬(Apis)[1]，其作為生態(tài)系統(tǒng)中的重要成員，對生物多樣性的促進(jìn)和生態(tài)平衡的維持具有重要意義。但自從2006年冬季以來，蜂群崩潰失調(diào)病(colony collapse disorder，CCD)席卷了美國、法國、瑞典、德國和澳大利亞等國，致使當(dāng)?shù)胤滢r(nóng)蜂群損失達(dá)50%～90%。CCD的癥狀為蜂群中大量的成年工蜂短時(shí)間內(nèi)突然消失在巢外，沒有發(fā)現(xiàn)尸體，只剩下蜂王、卵、一些未成年的工蜂和大量蜜粉殘留于巢脾里。誘發(fā)CCD的因素可能是疾病、農(nóng)藥、氣候、營養(yǎng)等[2-4]，但還沒有確定的答案。營養(yǎng)可能是CCD發(fā)生的主要因素之一，營養(yǎng)不良會影響蜜蜂的機(jī)體發(fā)育，甚至影響蜜蜂的歸巢能力和記憶相關(guān)基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致蜜蜂迷失方向并消失在巢外。但關(guān)于蜜蜂學(xué)習(xí)記憶相關(guān)基因表達(dá)的報(bào)道較少，科研人員通過克隆等試驗(yàn)推測西方蜜蜂的酪胺受體(tyramine receptor)1型基因(Tyr1)、N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor)1型基因(Nmdar1)以及谷氨酸受體(glutamate receptor)A型基因(GluRA)是參與西方蜜蜂學(xué)習(xí)記憶的重要基因[5-7]。近年來，蜜蜂蛋白質(zhì)營養(yǎng)需要研究取得了階段性成果，研究發(fā)現(xiàn)飼糧蛋白質(zhì)水平會影響卵的孵化率、幼蟲化蛹率和機(jī)體抗氧化活性等[8-12]，但還沒有關(guān)于飼糧蛋白質(zhì)水平是否會影響蜜蜂的歸巢能力及記憶相關(guān)基因表達(dá)的報(bào)道?；诖耍驹囼?yàn)擬研究飼糧蛋白質(zhì)水平對蜜蜂歸巢能力及記憶相關(guān)基因表達(dá)的影響，為探索CCD致病因素提供一些依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動物

試驗(yàn)動物為江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所飼養(yǎng)的本地意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica)，簡稱意蜂。

1.2主要試劑及器材

1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1蜂群的選擇與飼養(yǎng)管理

選取群勢相當(dāng)?shù)谋镜匾獯罄鄯?群內(nèi)無花粉脾)9群，隨機(jī)分為3組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)開始前將各試驗(yàn)組蜂群群勢調(diào)整至5足框，之后每組分別飼喂蛋白質(zhì)水平為15%、25%、35%的試驗(yàn)飼糧，具體飼糧配方參照文獻(xiàn)[10]。因試驗(yàn)期間外界有粉源，所以整個(gè)試驗(yàn)期間試驗(yàn)蜂群安裝脫粉器，并獎勵(lì)飼喂糖水。將3種不同蛋白質(zhì)水平的人工配合飼料分別按人工配合飼料∶糖∶蜜=2∶3∶1的比例混勻后加入適量水，反復(fù)揉搓，直到攥成團(tuán)狀為止。將飼糧制成餅狀，每群每次飼喂400 g，放置在梁框上供蜜蜂采食，每3 d更換1次飼糧。連續(xù)飼喂45 d后進(jìn)行后期的檢測試驗(yàn)。

1.3.2飼糧蛋白質(zhì)水平對采集蜂歸巢能力的影響

用吸蜂機(jī)在巢門口抓取帶花粉的采集蜂，參照何旭江[13]的試驗(yàn)方法對采集蜂進(jìn)行電子標(biāo)記，利用GPS全球定位儀分別在距離蜂巢1 000、2 000 m處進(jìn)行精確定位，將帶標(biāo)簽且采食足量糖水的蜜蜂帶至目的地點(diǎn)放飛，利用蜜蜂RFID記錄系統(tǒng)對其回巢情況進(jìn)行記錄，重復(fù)6次。

放飛蜜蜂有效數(shù)：在5 min之內(nèi)蜜蜂起飛歸巢的數(shù)量，剔除未能進(jìn)行正常飛行的蜜蜂。

回歸率=回巢蜜蜂數(shù)/放飛蜜蜂有效數(shù)。

1.3.3飼糧蛋白質(zhì)水平對工蜂記憶相關(guān)基因相對表達(dá)量的影響

1.3.3.1樣品采集

采取每群剛出房、10日齡和20日齡工蜂各20只，分別裝入1.5 mL RNase-free的EP管，迅速放入液氮中，用于后續(xù)檢測。

1.3.3.2RNA的提取與cDNA的合成

取3只同一蜂群、同一日齡的蜜蜂頭部混合為1個(gè)樣品，放入含液氮的研缽內(nèi)，研磨至粉末狀后移置加有1 mL Trizol的1.5 mL EP管中。參考秦秋紅[14]試驗(yàn)方法對樣本RNA進(jìn)行提取。最后所得總RNA通過瓊脂糖凝膠電泳評估RNA完整性。用核酸蛋白測定儀測定260和280 nm處吸光度值(OD)，計(jì)算二者的比值(OD260/280)(1.9～2.1之間符合標(biāo)準(zhǔn))，每個(gè)樣品測定3次，取平均值。

用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為50 μL，包含：8 μL總RNA，10 μL Buffer，8 μL dNTP Mixture，1.5 μL M-MLV，3 μL Oligo(dT)，1 μL RNA酶抑制劑，18.5 μL焦碳酸二乙酯(DEPC)水。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下：體系混勻后，42 ℃反應(yīng)60 min，75 ℃滅活5 min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-80 ℃。

1.3.3.3熒光定量PCR引物的設(shè)計(jì)及熒光定量PCR

根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站上所示西方蜜蜂基因組序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列(表1)。因甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)在蜜蜂發(fā)育過程中表達(dá)較穩(wěn)定[15]，所以本試驗(yàn)以GAPDH作為內(nèi)參基因。

表1　熒光定量PCR引物序列

1.4數(shù)據(jù)處理

采用StatView軟件“ANOVA andt-test”中的“ANOVA or ANCOVA”對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果

2.1飼糧蛋白質(zhì)水平對采集蜂歸巢能力的影響

由表2可知，Ⅱ組和Ⅲ組采集蜂在1 000、2 000 m處的回歸率均顯著高于Ⅰ組(P<0.05)，但Ⅱ組與Ⅲ組之間差異不顯著(P>0.05)。

表2　飼糧蛋白質(zhì)水平對意大利蜜蜂回歸率的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Values in the same row with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

2.2飼糧蛋白質(zhì)水平對工蜂GluRA相對表達(dá)量的影響

試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。各試驗(yàn)組剛出房工蜂的GluRA相對表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)。Ⅲ組10和20日齡工蜂的GluRA相對表達(dá)量顯著高于Ⅱ組和Ⅰ組(P<0.05)，同時(shí)Ⅱ組也顯著高于Ⅰ組(P<0.05)。

2.3飼糧蛋白質(zhì)水平對工蜂Nmdar1相對表達(dá)量的影響

試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。各試驗(yàn)組剛出房工蜂的Nmdar1相對表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)。Ⅱ組和Ⅲ組10和20日齡工蜂的Nmdar1相對表達(dá)量顯著高于Ⅰ組(P<0.05)，但Ⅱ組與Ⅲ組之間差異不顯著(P>0.05)。

2.4飼糧蛋白質(zhì)水平對工蜂Tyr1相對表達(dá)量的影響

試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。各試驗(yàn)組剛出房和20日齡工蜂的Tyr1相對表達(dá)量差異均不顯著(P>0.05)。Ⅱ組和Ⅲ組10日齡工蜂的Tyr1相對表達(dá)量顯著高于Ⅰ組(P<0.05)，但Ⅱ組與Ⅲ組之間差異不顯著(P>0.05)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)；圖A、B、C分別表示為剛出房工蜂、10日齡工蜂、20日齡工蜂。下圖同。

Date columns with the same letters mean no significant difference (P>0.05), while with different letters mean significant difference (P<0.05); the figures of A, B, C mean newly emerged bee, 10-day-old bee and 20-day-old bee. The same as below.

圖1飼糧蛋白質(zhì)水平對工蜂GluRA相對表達(dá)量的影響

Fig.1Effects of dietary protein level on the relative expression level ofGluRAof worker bees

圖2　飼糧蛋白質(zhì)水平對工蜂Nmdar1相對表達(dá)量的影響

圖3　飼糧蛋白質(zhì)水平對工蜂Tyr1相對表達(dá)量的影響

3討論

蜜蜂是一種全變態(tài)昆蟲，個(gè)體發(fā)育要經(jīng)過卵、幼蟲、蛹和成蟲4個(gè)階段，其中幼蟲階段和成蟲階段需要進(jìn)食、消化與吸收營養(yǎng)食物。成蟲階段蜜蜂(工蜂)進(jìn)食的天然食物主要是花粉和蜂蜜。幼蟲階段的前期主要由工蜂分泌蜂王漿進(jìn)行飼喂，其蜂王漿的營養(yǎng)成分與工蜂進(jìn)食的食物有關(guān)。幼蟲階段的后期由工蜂飼喂蜂糧，即花粉和蜂蜜的混合發(fā)酵物。然而，在外界缺少蜜粉源的早春，養(yǎng)蜂生產(chǎn)者常常使用花粉代用品(蛋白質(zhì)飼糧)和糖水。不同蛋白質(zhì)水平的花粉代用品對蜜蜂個(gè)體體重、咽下腺發(fā)育以及抗氧化性能具有明顯的影響[8-12]，從而影響著蜂群的群勢和產(chǎn)漿性能等。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Ⅱ組和Ⅲ組采集蜂在1 000、2 000 m處的回歸率均顯著高于Ⅰ組，但Ⅱ組與Ⅲ組之間差異不顯著。這說明蜜蜂飼糧中蛋白質(zhì)水平過低會影響采集蜂的歸巢能力。其主要原因在于剛出生的工蜂在后期發(fā)育時(shí)需要大量蛋白質(zhì)來使自身機(jī)體進(jìn)一步發(fā)育成熟，過低的蛋白質(zhì)水平會影響工蜂的后期發(fā)育，從而使其生理機(jī)能下降，導(dǎo)致其歸巢能力降低。

GluRA廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，在西方蜜蜂中被認(rèn)為是一種促代謝性的谷氨酸受體基因，并影響著蜜蜂的長期學(xué)習(xí)記憶能力，是蜜蜂學(xué)習(xí)記憶生理過程的關(guān)鍵神經(jīng)遞質(zhì)[7]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Ⅲ組10和20日齡工蜂的GluRA相對表達(dá)量均顯著高于Ⅱ組和Ⅰ組，且Ⅱ組10和20日齡工蜂的GluRA相對表達(dá)量也顯著高于Ⅰ組。這說明飼糧蛋白質(zhì)水平顯著影響10和20日齡工蜂的GluRA的表達(dá)。工蜂剛出房后需要采集高蛋白質(zhì)水平飼糧使其自身內(nèi)部器官得到進(jìn)一步發(fā)育，從而完善其機(jī)體機(jī)能，特別是為了后期采集花粉、花蜜，需要良好的長期記憶能力，從而提高采集歸巢能力。

Nmdar1與西方蜜蜂學(xué)習(xí)記憶有關(guān)，并廣泛存于蜜蜂大腦的蘑菇體凱恩細(xì)胞和其他神經(jīng)器官中[6]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Ⅱ組和Ⅲ組10和20日齡工蜂的Nmdar1相對表達(dá)量顯著高于Ⅰ組，但Ⅱ組與Ⅲ組之間差異不顯著。這說明飼糧蛋白質(zhì)水平過低影響著工蜂腦部神經(jīng)器官的發(fā)育，從而降低了記憶相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響蜜蜂的歸巢能力，這與蜜蜂放飛歸巢試驗(yàn)結(jié)果一致。

Tyr1是昆蟲體內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，調(diào)控昆蟲飛行以及學(xué)習(xí)與記憶等生理行為[16-17]，也是一種參與西方蜜蜂學(xué)習(xí)記憶的重要基因[5]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Ⅱ組和Ⅲ組10日齡工蜂的Tyr1相對表達(dá)量顯著高于Ⅰ組，但Ⅱ組與Ⅲ組之間差異不顯著。這說明不同蛋白質(zhì)水平飼糧對工蜂Tyr1表達(dá)有一定的影響，過低的蛋白質(zhì)水平影響著工蜂的記憶能力。然而，飼糧蛋白質(zhì)水平對20日齡工蜂的Tyr1相對表達(dá)量的影響不顯著，主要原因可能是Tyr1與調(diào)節(jié)蜜蜂短時(shí)記憶有關(guān)，如蜜蜂認(rèn)巢試飛，而與蜜蜂采集時(shí)的長期記憶無關(guān)。何旭江[13]研究發(fā)現(xiàn)，蜜蜂的首次認(rèn)巢認(rèn)飛活動主要集中在7～11日齡，即此日齡段需要較高的Tyr1，具體原因有待于進(jìn)一步研究與分析。

另外，本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，剛出房工蜂的GluRA、Nmdar1和Tyr1相對表達(dá)量各試驗(yàn)組之間差異不顯著，可能是因?yàn)楣し洳墒巢煌鞍踪|(zhì)水平飼糧后，其分泌的蜂王漿中的一些主要活性因子差異不顯著，如10-羥基-2-癸烯酸(10-HDA，又稱王漿酸)[18]，對蜜蜂幼蟲發(fā)育影響較小，具體原因有待于進(jìn)一步深入研究。

4結(jié)論

飼糧蛋白質(zhì)水平影響意大利蜜蜂記憶相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響其歸巢能力。在日常飼喂蜂群時(shí)，飼糧蛋白質(zhì)水平不應(yīng)低于25%。

致謝：

感謝山東農(nóng)業(yè)大學(xué)胥保華教授團(tuán)隊(duì)提供試驗(yàn)蛋白質(zhì)飼糧！

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(責(zé)任編輯菅景穎)

Effects of Dietary Protein Level on Homing Capability and Memory Related Gene Expression ofApismelliferaligustica

YUAN AnGUO YahuiWU Xiaobo*HUANG XiaoLIAO Chunhua

(Honeybee Research Institute, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

Abstract:The objective of this experiment was to explore the effects of dietary protein level on homing capability and memory related gene expression of Apis mellifera ligustica. Nine colonies of local Apis mellifera ligustica with equal colony population were randomly divided into 3 groups with 3 replicates in each group. Bees in groups Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ were fed diets containing 15%, 25%, 35% protein, respectively. In this study, the homing rate of foragers in the 1 and 2 km away after feeding 45 days and the expression levels of three memory related genes [glutamate receptor type A gene (GluRA), N-methyl-D-aspartic acid receptor type 1 gene(Nmdar1) and tyramine receptor type 1 gene (Tyr1)] in different day-old (newly emerged, 10-day-old and 20-day-old) worker bees were detected. The results showed that the homing rates in the 1 and 2 km away in groups Ⅱ and Ⅲ were significantly higher than those in group Ⅰ (P<0.05), while there was no significant difference between groups Ⅱ and Ⅲ (P>0.05). The expression level of GluRA of 10-day-old and 20-day-old worker bees in group Ⅲ was significantly higher than that in group Ⅰ and Ⅱ (P<0.05), and that in group Ⅱ was significantly higher than that in group Ⅰ (P<0.05). The expression level of Nmdar1 of 10-day-old and 20-day-old worker bees in groups Ⅱ and Ⅲ was significantly higher than that in group Ⅰ (P<0.05), but there was no significant difference between groups Ⅱ and Ⅲ (P>0.05). The expression level of Tyr1 of 10-day-old worker bees in groups Ⅱ and Ⅲ was significantly higher than that in group Ⅰ (P<0.05), but there was no significant difference between groups Ⅱ and Ⅲ (P>0.05). Besides that, there were no significant differences in the expression levels of GluRA, Nmdar1 and Tyr1 of newly emerged worker bees among the three groups (P>0.05), and the expression level of Tyr1 of 10-day-old worker bees among the three groups also had no significant difference (P>0.05). In conclusion, the lower level of protein in the diet may infect the homing ability and the expression of memory related genes of Apis mellifera ligustica.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(1)：296-302]

Key words:Apis mellifera ligustica; protein level; homing rate; memory genes

*Corresponding author, associate professor, E-mail: wuxiaobo21@163.com

中圖分類號：S894

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-267X(2016)01-0296-07

作者簡介：袁安(1989—)，男，江西萬載人，碩士研究生，從事養(yǎng)蜂學(xué)研究工作。E-mail: 1248215336@qq.com*通信作者：吳小波，副教授，E-mail: wuxiaobo21@163.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360587)

收稿日期：2015-09-15

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.01.038