周　洲，王紅梅，張　晗，賀紅，，韓　梅，陳艷卿

(1.中國環(huán)境科學(xué)研究院，北京 100012；2.中央民族大學(xué)，北京 100081)

?

氯化鈉溶液對(duì)微量血氟電極法測定的影響

周洲1，王紅梅1，張晗2，賀紅1，2，韓梅1，陳艷卿1

(1.中國環(huán)境科學(xué)研究院，北京 100012；2.中央民族大學(xué)，北京 100081)

摘要：將加標(biāo)血清樣本與總離子強(qiáng)度調(diào)整液(TISAB)1∶1體積混合后加入不同濃度的NaCl飽和溶液，測定血清氟含量。結(jié)果顯示對(duì)不同的生物血清樣本，NaCl飽和溶液添加量對(duì)氟離子選擇電極測定影響程度不同；微量小牛血清樣本氟含量測定時(shí)NaCl飽和溶液的最佳加入量為20μL；大鼠血清樣本氟含量測定時(shí)NaCl飽和溶液的最佳加入量為40 μL。運(yùn)用此方法分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)添加的小牛血清和大鼠血清進(jìn)行測定，結(jié)果顯示該方法簡便、快速，準(zhǔn)確度和精密度均達(dá)到分析要求。

關(guān)鍵詞：微量血清；血氟；氟電極測量；NaCl飽和溶液

氟元素為人體必需的微量元素之一。適量的氟能幫助牙齒和骨骼的正常健康發(fā)育，但是過量的氟攝入會(huì)導(dǎo)致氟斑牙及氟骨病等地氟病的發(fā)生。地氟病是我國許多地區(qū)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一[1,2]。人體(或其它動(dòng)物)血、尿樣本中氟離子的蓄積水平是衡量一個(gè)地區(qū)人群攝氟量水平和地方性氟中毒監(jiān)測和防治效果的重要指標(biāo)和依據(jù)[3,4]。對(duì)血清樣本氟蓄積水平的研究成為環(huán)境、食品與環(huán)境管理部門的科研熱點(diǎn)。相比工業(yè)含氟廢水或其它環(huán)境樣本而言，血清樣本量十分有限，通常<5mL。如何科學(xué)地對(duì)微量血清氟進(jìn)行測定，直接影響氟內(nèi)暴露分析的準(zhǔn)確性。

氟離子選擇電極法、離子色譜法和分光光度法是最常見的血氟測定方法。其中氟離子選擇電極法是測定溶液中氟離子最典型的方法，在我國氟化物檢測標(biāo)準(zhǔn)中均有應(yīng)用[5,6]。氟離子選擇電極法有結(jié)構(gòu)簡單牢固、元件靈巧、靈敏度高、響應(yīng)速度快、能克服色澤干擾以及精密度高等優(yōu)點(diǎn)[7,8]，在人群調(diào)查及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱鷻z測中被廣泛應(yīng)用[9,10]。

然而，電極法檢測時(shí)樣本量一般在4～5 mL，將其應(yīng)用到微量血清樣本仍缺少方法探索；且不同生物樣本血清測定時(shí)由于含有不同離子及蛋白的干擾，導(dǎo)致測定時(shí)會(huì)存在離子活度被干擾，儀器讀數(shù)不穩(wěn)定，上下跳動(dòng)的現(xiàn)象。添加氯化鈉飽和溶液有助于提高離子活度，但對(duì)不同生物樣本測定時(shí)如何選擇添加量尚缺少系統(tǒng)研究。

本課題立足于氟離子選擇電極測定微量血清樣本的方法探索，并就NaCl飽和溶液添加量進(jìn)行討論，確定最佳添加量使分析結(jié)果的準(zhǔn)確度和靈敏度得到優(yōu)化。

1材料和方法

1.1儀器

離子計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器，PXS-270；

氟離子選擇電極：上海儀電科學(xué)儀器，雷磁PF-2-01；

震蕩機(jī)：其林貝爾儀器制造，GL-901；

移液槍：eppendorf公司制造，(1mL)、 ppetman公司制造，(100μL)。

實(shí)驗(yàn)所有器皿均用去離子水清洗干凈，烘干備用。

1.2試劑

氟化鈉(高級(jí)純)，冰乙酸(優(yōu)級(jí)純)，氯化鈉(優(yōu)級(jí)純)，氫氧化鈉(優(yōu)級(jí)純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。EDTA(優(yōu)級(jí)純)，AMERSCO試劑公司。小牛血清，Sigma P7794。大鼠血清, Equitech-Bio RTS-0050。

TISAB：稱取270g 檸檬酸三鈉和24g檸檬酸水，用水溶解，移至1000mL容量瓶中，加水稀釋至1000mL刻度線，搖勻。

NaCl飽和溶液：向100mL去離子水中溶解NaCl晶體，至溶液中存在不溶晶體。

氟化物標(biāo)準(zhǔn)貯備液：稱取已于105 ℃烘干2h的優(yōu)級(jí)純氟化鈉(NaF)0.2210g溶于去離子水中，移入1000mL量瓶中，稀釋至標(biāo)線，混勻貯于聚乙烯瓶中備用，此溶液100mg/L。

氟化物標(biāo)準(zhǔn)使用液:吸取氟化物標(biāo)準(zhǔn)貯備液10.00mL，移入100mL容量瓶，用去離子水稀釋至標(biāo)線，貯于聚乙烯瓶中，此溶液濃度10mg/L。

1.3測定樣品制備

將購買的標(biāo)準(zhǔn)小牛血清血樣和大鼠血樣從冰箱中取出，放置恢復(fù)至室溫后，充分搖勻，作為模擬血清樣本。

1.4儀器操作條件

儀器操作溫度為25 ℃，測定時(shí)使用的參比電極中飽和氯化鉀溶液充足，距離加液口2～3mm，電極測量前用去離子水沖洗拭干。

1.5實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)使用2.0mL有刻度塑料離心管，按預(yù)先設(shè)定好的濃度梯度0.05、0.10、 0.20、0.40、0.80和1.00μg/mL移取氟化鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液，每一濃度梯度制備6個(gè)樣本，分別用以探索不同氯化鈉加入量對(duì)氟離子選擇電極法測定的影響，氯化鈉飽和溶液探索加入量為0.0、10.0、20.0、30.0、40.0和50.0μL。每個(gè)測量樣本血清及TISAB溶液具體加入量見表1，最后用去離子水定容至1.0mL測量。

1.6樣品測定

按照設(shè)定好的藥劑加入量配制好樣本，共72個(gè)樣本，在振蕩機(jī)上充分震蕩均勻，按從低濃度到高濃度順序測定。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1氟離子濃度的影響

將不同濃度(0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.40μg/mL、0.80μg/mL和1.00μg/mL)的標(biāo)樣分別加入小牛血清及大鼠血清中，然后加入10、20、30、40、50μL 的NaCl飽和溶液，各樣本最終測定總體積為1mL，將最終體積的樣本轉(zhuǎn)入微量塑料杯中。雷磁氟電極提前打開，以二次去離子水淋洗后拭干，直接浸入溶液中進(jìn)行測定。

記錄不同氯化鈉加入量時(shí)測定的電壓值，總結(jié)氯化鈉加入量與電壓之間的結(jié)果，見圖1。

表1　樣本藥劑加入量一覽表

從圖1 a中可知，在小牛血清標(biāo)樣中，不同氟離子濃度樣本穩(wěn)定電壓讀數(shù)對(duì)應(yīng)的NaCl飽和溶液添加量范圍不同。 0.05μg/mL 氟離子濃度水平在20～40μL范圍內(nèi)保持讀數(shù)穩(wěn)定，0.10μg/mL 氟離子濃度水平的樣本在20～40μL的NaCl飽和溶液加入量保持讀數(shù)穩(wěn)定,0.20μg/mL 氟離子濃度水平的樣本在10～30μL的NaCl飽和溶液加入量保持讀數(shù)穩(wěn)定， 0.40及0.80μg/mL氟離子濃度水平的小牛血清樣本均在20～50μL的NaCl飽和溶液加入讀數(shù)保持穩(wěn)定，1.00μg/mL氟離子濃度水平的樣本在20～40μL的NaCl飽和溶液加入量保持讀數(shù)穩(wěn)定。對(duì)氯化鈉加入量的選擇依據(jù)應(yīng)該為盡量使電壓值低，因?yàn)檫@樣測定結(jié)果可以快速達(dá)到穩(wěn)定，重現(xiàn)性好；同時(shí)在不同濃度的氟含量樣本中，讀數(shù)穩(wěn)定對(duì)應(yīng)的氯化鈉加入量應(yīng)選擇相同范圍，保證不同濃度樣本測定結(jié)果精確度一致。

因此，分析小牛血清NaCl飽和溶液加入量示意圖1 a，圖中陰影Ⅰ區(qū)為NaCl飽和溶液的最佳加入量，即為20～40μL，也就是說小牛血清的測定最佳加入量為20～40μL時(shí)，樣本的測定快速穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，且精確度可在不同濃度樣本內(nèi)達(dá)到一致。

從圖2b中可知，不同于小牛血清，NaCl飽和溶液加入量對(duì)大鼠血清樣本讀數(shù)波動(dòng)影響與氟濃度相關(guān)，0.05和0.20μg/mL氟離子濃度水平在20～40 μL范圍內(nèi)保持讀數(shù)穩(wěn)定，0.10μg/mL氟離子濃度水平的樣本是在30～50μL的NaCl飽和溶液加入量保持讀數(shù)穩(wěn)定，其余氟離濃度子的血清樣本均在NaCl飽和溶液加入量為0～20，40μL時(shí)讀數(shù)不變。

與小牛血清相同的選擇原則，目的是要保證樣本讀數(shù)快速穩(wěn)定、重現(xiàn)性好及不同濃度樣本測定結(jié)果的精確度一致。因此，分析大鼠血清NaCl飽和溶液加入量示意圖，圖中陰影Ⅰ和Ⅱ區(qū)為NaCl飽和溶液的最佳加入量，即為20及40μL，此加入量時(shí)樣本的測定快速穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，且精確度可在不同濃度樣本內(nèi)達(dá)到一致。

2.2對(duì)標(biāo)線的影響

根據(jù)NaCl飽和溶液加入量將檢測數(shù)據(jù)分組，分別擬合不同組的標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合曲線及參數(shù)見圖2，擬合方程式見表2。

NaCl飽和溶液加入量/μL小牛血清大鼠血清0y=42.755x+62.657y=44.47x+58.81910y=41.535x+70.587y=45.106x+48.06220y=48.796x+33.46y=48.463x+32.74530y=48.692x+34.63y=48.566x+32.57440y=48.108x+37.803y=47.524x+37.97550y=47.51x+43.109y=46.378x+43.546

從圖2a及表2可知， NaCl飽和溶液加入量會(huì)影響小牛血清氟標(biāo)線的擬合。6組標(biāo)線擬合方程系數(shù)各不相同，其中當(dāng)NaCl飽和溶液加入量為20μL時(shí)，R2值均為0.9954，該組標(biāo)線的擬合程度最好，且標(biāo)線方程各系數(shù)一致，表示檢測樣本離子活度穩(wěn)定；當(dāng)加入量為50μL時(shí)，R2值為0.9866，標(biāo)線擬合程度最差，其余4組標(biāo)線擬合程度相差不大。

以標(biāo)線的擬合程度及標(biāo)線方程的重現(xiàn)性作為氯化鈉加入量的選擇依據(jù)，圖2a及表2所示結(jié)果表明，滿足選擇依據(jù)的R2最大值為0.9954，對(duì)應(yīng)的NaCl飽和溶液加入量為20μL，且該組擬合標(biāo)線系數(shù)一致，重現(xiàn)性好。即小牛血清測定時(shí)，NaCl飽和溶液加入量為20 μL時(shí)標(biāo)線擬合程度、重現(xiàn)性最好。

從圖2b及表2中可知，NaCl飽和溶液加入量對(duì)大鼠血清氟標(biāo)線的擬合影響較小牛血清小，6組標(biāo)線擬合程度明顯優(yōu)于小牛血清。當(dāng)NaCl飽和溶液加入量為40μL時(shí)，R2值為0.9974，為6組標(biāo)線中R2數(shù)值最高值；當(dāng)加入量為50μL 時(shí)，R2值均為0.9861，R2值最低，方程擬合程度最差。從擬合曲線方程式可以明顯看出NaCl飽和溶液加入量為40μL時(shí)，擬合方程的重現(xiàn)性好，方程各系數(shù)相差較小。

根據(jù)標(biāo)線的擬合程度及標(biāo)線方程的重現(xiàn)性，圖2b及表2所示的結(jié)果表明，滿足選擇依據(jù)的R2最大值為0.9974，對(duì)應(yīng)的NaCl飽和溶液加入量為40μL，該劑量的NaCl飽和溶液加入量，標(biāo)線擬合程度、重現(xiàn)性最好。

2.3方法確定

根據(jù)氯化鈉加入量的選定原則，在相同濃度的標(biāo)樣測定時(shí)，盡量使電壓值低，同時(shí)在不同濃度的氟含量樣本中，讀數(shù)穩(wěn)定對(duì)應(yīng)的氯化鈉加入量應(yīng)選擇相同范圍，同時(shí)保證標(biāo)線的擬合程度最高，標(biāo)線的重現(xiàn)性好，以保證樣本讀數(shù)快速穩(wěn)定、重現(xiàn)性好及不同濃度樣本測定結(jié)果的精確度一致。

在小牛血清中，不同濃度水平的共同穩(wěn)定讀數(shù)范圍對(duì)應(yīng)的NaCl飽和溶液投加量范圍為20～40μL，標(biāo)線擬合程度最高、標(biāo)線方程重現(xiàn)性最好對(duì)應(yīng)的NaCl飽和溶液加入量為20μL。所以確定氟離子選擇電極測定微量小牛血清樣本時(shí)，起提高離子活度作用的NaCl飽和溶液最佳加入量為20μL。

與小牛血清相比，NaCl飽和溶液的投加量對(duì)不同氟離子濃度水平的微量大鼠血清樣本影響不同，共同穩(wěn)定讀數(shù)范圍對(duì)應(yīng)的NaCl飽和溶液投加量范圍為20μL及40μL；而標(biāo)線擬合時(shí)，標(biāo)線方程重現(xiàn)性最好對(duì)應(yīng)的NaCl飽和溶液加入量范圍為40μL。所以確定氟離子選擇電極法測定微量大鼠血清樣本時(shí)，起穩(wěn)定離子強(qiáng)度作用的NaCl飽和溶液加入量為40μL。

2.4檢出限及樣本本底值

PF-2-01型氟離子電極的可應(yīng)用測量范圍為1～10-6mol/L，最低檢出限為10-6mol/L，即為0.019μg/mL。

平均測定了小牛血清空白溶液(即加氟濃度為0μg/mL)9次，平均電壓為331.67mv，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)為0.74%，平均含氟量低于儀器檢出限，視為未檢出；平均測定了大鼠血清空白溶液9次，平均電壓為300.56mv，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)為0.38 %，平均含氟量為0.1018μg/mL。

2.5精密度與加標(biāo)回收試驗(yàn)

根據(jù)2.3所述確定的NaCl飽和溶液加入量，在相同的氟電極測定條件下，分別用同一小牛血清樣本及大鼠樣本進(jìn)行7次重復(fù)的測定，測定結(jié)果見表3。

結(jié)果表明，無論是什么種類的血清，氟離子選擇電極法測定微量血清中氟離子的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均<5 %，精密度良好。

在小牛血清及大鼠血清的空白樣本中，加入已知量F-標(biāo)準(zhǔn)品，每種血清配成7個(gè)已知樣品，在相同的氟離子選擇電極測定條件下定量分析，計(jì)算測得小牛血清樣本中F-的平均回收率為100.48%，大鼠血清樣本中F-的平均回收率為108.92 %，實(shí)驗(yàn)具體結(jié)果見表4。

表3　精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果　(n=7)

表4　加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.6注意事項(xiàng)

試驗(yàn)所用的小牛血清樣本及大鼠血清樣本從-40℃拿出后室溫化凍；試驗(yàn)所用的玻璃洗凈后，必須使用去離子水潤洗3遍，烘干備用；試驗(yàn)過程使用水均為去離子水，防止外源氟離子帶入；試驗(yàn)使用樣本盛器1.5mL塑料離心管均為一次性使用材料，確保操作過程中無外源氟污染。

3小結(jié)

血清氟離子測定基于指示電極端表面的氟化鑭單晶膜(摻入微量氟化銪)，單晶膜中氟化銪為2配位，氟化鑭為3配位，當(dāng)大量氟化鑭參雜微量氟化銪時(shí)，會(huì)在單晶膜內(nèi)形成配位空穴，測定時(shí)溶液中的氟離子就會(huì)進(jìn)入單晶膜，進(jìn)而形成雙電層，使得以飽和甘汞電極作參比電極的測量電池電位發(fā)生改變，即電池電動(dòng)勢與試液中氟離子活度的對(duì)數(shù)成正比，一般在1～10-6mol/L范圍內(nèi)符合能斯特方式，基于此原理以測定樣本的電動(dòng)勢反推樣本的含氟濃度。

在血清氟的測定中，由于不同生物樣本血清成份復(fù)雜，本底值有差異，實(shí)驗(yàn)過程中容易被干擾，存在讀數(shù)不穩(wěn)定的問題。通過添加飽和氯化鈉溶液增強(qiáng)溶液的離子活度，可以去除其它本底物的干擾。對(duì)不同生物血清樣本如何加入合適的氯化鈉，需要探索。

本課題推薦的探索流程為：①分別確定小牛血清和大鼠血清不同氟濃度時(shí)穩(wěn)定讀數(shù)對(duì)應(yīng)的氯化鈉加入量范圍，小牛血清范圍為20～40μL，大鼠血清范圍為20和40μL;②根據(jù)標(biāo)線擬合程度及標(biāo)線方程的重現(xiàn)性確定氯化鈉加入量范圍，小牛血清標(biāo)線擬合最佳范圍為20μL，大鼠血清標(biāo)線擬合最佳范圍為40μL；③綜合穩(wěn)定讀數(shù)范圍和標(biāo)線擬合最佳范圍，確定小牛血清氟離子電極測定時(shí)氯化鈉最佳加入量為20μL，大鼠血清氯化鈉最佳加入量為40μL。

使用確定的方法分別多次測量小牛血清和大鼠血清的空白樣本和加標(biāo)樣本。小牛血清的空白樣接近儀器的檢出限，未檢出，RSD為0.74 %；大鼠血清的空白樣氟濃度為0.1018μg/mL，RSD為0.38 %。小牛血清加標(biāo)樣本中F-的平均回收率為100.48 %，RSD為4.91 %；大鼠血清樣本中F-的平均回收率為108.92 %，RSD為4.49 %。測定結(jié)果數(shù)據(jù)在生物樣本檢測精確度要求范圍內(nèi)，視為微量血清樣本的氟離子選擇電極測定方法的準(zhǔn)確度和精確度保持在一個(gè)較高水平，且方法操作簡單易行，數(shù)據(jù)收集快速精確?？稍谌巳毫鞑≌{(diào)研或動(dòng)物模擬暴露實(shí)驗(yàn)中推廣使用，解決血清樣本多、量少帶來的檢測時(shí)間長、檢測方法限制的問題。

參考文獻(xiàn)：

[1]黎昌健, 蒙衍強(qiáng), 蔣才武. 地氟病在中國大陸的流行現(xiàn)狀[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué), 2008, 15(4):1295-1301.

[2]涂俊, 劉克儉, 李明峰, 等. 職業(yè)性氟接觸人群血氟、尿氟水平及相關(guān)因素研究[J]. 中國工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志, 2010,23(3):163-167.

[3]問縣芳, 習(xí)海玲, 陳立坤, 等. 氟離子選擇電極法的可靠性研究[J]. 公共安全中的化學(xué)問題研究進(jìn)展, 2011(2): 818-822.

[4]李建國, 李菊梅. 氟離子選擇電極法在測試中應(yīng)注意的問題[J]. 分析試驗(yàn)室, 2001, 20(1)：97-98.

[5]王嬋娟， 單可人，劉艷潔，等. 畢節(jié)市人群乙肝感染狀況及血氟含量檢測[J].中國公共衛(wèi)生, 2009, 25(8)：1001-1002.s

Research on the Impacts of Addition of Sodium Chloride on Fluoride in Micor-volume Serum Samples by Fluoride Ion Selective Electrode

ZHOU Zhou1, WANG Hong-mei1, ZHANG Han1, HE Hong1,2,HAN Mei1, CHEN Yan-qing1

(1.Department of Environment and Health, Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012 ,China)

Abstract：Trace serum samples were diluted to 1 times by the total ionic strength adjustment buffer (TISAB) and added the standard sodium fluoride and different amount of NaCl saturated solution. The results showed that the effects by NaCl addition were different in different biological serum samples due to different background values. For calf serum sample, the optimal amount of NaCl saturated solution was 20 μL, while the optimal amount of NaCl saturated solution was 40 μL in rat serum samples. The serums from calf and rat added by the known addition standards have been measured. The relative standard deviation (RSD) was 4.91 % with the scope of recovery rates ranged from 90.72 % to 104.52 % in calf serum sample. Meanwhile, the relative standard deviation (RSD) in rat serum sample was 4.49 % with the recovery rates ranged from 97.11 % to 104.52 %.

Key words：trace serum; fluoride; fluoride ion selective electrode method; NaCl saturated solution

收稿日期：2015-09-14

基金項(xiàng)目：中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)(2012-YSKY-01)支持。

作者簡介：周洲(1990-)，女，在讀研究生，主要研究方向?yàn)榄h(huán)境污染與健康。通訊作者：王紅梅(1971-)，女，博士，研究員，導(dǎo)師，主要從事環(huán)境毒理與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究。

中圖分類號(hào)：X83

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1673-9655(2016)02-0095-05