劉健美，么宏偉，吳洪軍，馮磊*

(1.黑龍江省林業(yè)科學(xué)院，哈爾濱150081；2.黑龍江省林副特產(chǎn)研究所)

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榆耳復(fù)合防腐劑的抑菌效果及作用方式

劉健美1，么宏偉2，吳洪軍2，馮磊1*

(1.黑龍江省林業(yè)科學(xué)院，哈爾濱150081；2.黑龍江省林副特產(chǎn)研究所)

摘要：為了明確黑木耳多糖和榆耳水提液的抑菌作用方式和機(jī)制，以及其與Nisin復(fù)合形成的天然生物防腐劑的抑菌作用效果和作用方式。采用雙層抑菌平板法，測(cè)出的抑菌圈根據(jù)Nisin的效價(jià)，分別計(jì)算出樣品對(duì)各種菌的效價(jià)。最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定，以不長(zhǎng)菌的最低榆耳水提液及復(fù)配液濃度為對(duì)該菌的最小抑菌濃度。采用生長(zhǎng)曲線法和瓊脂塊再培養(yǎng)法來(lái)測(cè)定榆耳水提液及天然防腐劑復(fù)配液的抑菌作用方式。結(jié)果表明，復(fù)合防腐劑對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等均有良好的抑菌效果?？疾炝松L(zhǎng)過(guò)程中的活菌數(shù)，發(fā)現(xiàn)前6h活菌數(shù)顯著降低，從106 cfu/mL降低至102 cfu/mL，在12h以后含有20%的復(fù)配液的培養(yǎng)基幾乎沒(méi)有菌的生長(zhǎng)，這說(shuō)明復(fù)配液具有較強(qiáng)的殺菌作用。

關(guān)鍵詞：榆耳復(fù)合防腐劑；抑菌效果；作用方式

研究防腐劑抑菌物質(zhì)的作用機(jī)制，對(duì)于評(píng)價(jià)該物質(zhì)在食品中的應(yīng)用前景有重要意義[1]。天然防腐劑抑菌或殺菌的作用機(jī)制比較復(fù)雜，包括干擾細(xì)胞質(zhì)膜、破壞或損失細(xì)胞壁，致使胞內(nèi)物質(zhì)外泄，影響有關(guān)呼吸鏈電子傳遞系統(tǒng)，或影響DNA、RNA合成等，抑制酶活性，干擾正常代謝[2]。目前殼聚糖的抗菌機(jī)理目前已提出多種解釋，認(rèn)為殼聚糖與細(xì)菌表面殘基相互作用，引起細(xì)胞滲透壓變化，抑制菌體正常生理代謝，導(dǎo)致細(xì)胞死亡?；蚴桥cDNA作用，抑制RNA和蛋白合成[3]。Nisin通過(guò)干擾細(xì)胞膜正常功能，造成物質(zhì)泄漏、養(yǎng)分流失導(dǎo)致細(xì)菌死亡[4]。前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了黑木耳多糖和榆耳水提液的抑菌效果，但其作用方式和機(jī)制還不清楚。因此與Nisin復(fù)合形成的天然生物防腐劑的抑菌作用效果和作用方式的闡明，對(duì)于后期復(fù)合防腐劑的應(yīng)用具有重要的理論意義。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

金黃色葡萄球菌(Staphylociccusaureus)；大腸桿菌(Escherichiacoli)沙門(mén)氏菌(Salmonella)；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)； 蠟樣芽孢桿菌 (Bacilluscereus)，均為黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院食品分析試驗(yàn)室提供。牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，雙層抑菌培養(yǎng)基(實(shí)驗(yàn)室制備)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1天然防腐劑的制備。榆耳復(fù)配天然防腐劑(實(shí)驗(yàn)室制備)： 4℃保藏備用。

1.2.2供試菌液的制備。保藏菌種接入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基內(nèi)(50/250mL的三角瓶)，置于恒溫?fù)u床上活化培養(yǎng)，保持轉(zhuǎn)速在 150～160r/min，細(xì)菌在 37℃條件下培養(yǎng) 24h，傳代2次，進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.3抑菌試驗(yàn)

1.2.3.1雙層抑菌平板法(杯碟法)。本試驗(yàn)采用雙層抑菌平板法即杯碟法測(cè)定榆耳及榆耳復(fù)配液的抑菌活性。具體操作如下：取已滅菌的培養(yǎng)皿水平放置于超凈工作臺(tái)上，倒入適量已滅菌的下層培養(yǎng)基，輕轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿使其均勻鋪平，待其凝固做為底層；取已滅菌的牛津杯(10 mm×8 mm×6mm)均勻放置其上(每皿不超過(guò) 6 支)，另取已滅菌的相應(yīng)上層培養(yǎng)基5mL，冷卻至 50℃左右，將已培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌培養(yǎng)液，菌濃度為106cfu/mL，按照細(xì)菌培養(yǎng)液：上層培養(yǎng)基為1∶5(體積比)的比例加入其中，迅速混勻，趁熱倒在底層培養(yǎng)基上，均勻攤布，靜止放于臺(tái)面上凝固后，依試驗(yàn)要求在牛津杯中加入待測(cè)樣品0.1mL，做重復(fù)試驗(yàn)。加好樣品后，靜止1～2min 后蓋上培養(yǎng)皿蓋，待上層培養(yǎng)基凝固后，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(細(xì)菌37℃，24h)。上述過(guò)程嚴(yán)格要求無(wú)菌操作，并盡量保持培養(yǎng)基厚度一致，加菌量和待測(cè)樣品量相同且在操作中防止氣泡產(chǎn)生和樣品溢出。待菌苔長(zhǎng)好后即可觀察抑菌圈，并記錄抑菌圈直徑以比較各樣品的抑菌活性。測(cè)出的抑菌圈根據(jù)Nisin的效價(jià)，分別計(jì)算出樣品對(duì)各種菌的效價(jià)。

1.2.3.2最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定。取子實(shí)體水提液與榆耳復(fù)配液加已滅菌的蒸餾水配制成一定梯度的稀釋液(水提液含量分別占 10%、15%、20%、25%、50%、80%、100%)。在對(duì)應(yīng)的固體培養(yǎng)平板中分別添加不同濃度稀釋液各0.1mL，再分別添加各菌懸液0.2mL，均勻涂布滿整個(gè)平皿，蓋上皿蓋，待其稍干后倒置于適宜溫度的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(細(xì)菌37℃ 18h)，以不長(zhǎng)菌的最低榆耳水提液及復(fù)配液濃度為對(duì)該菌的最小抑菌濃度。本次試驗(yàn)利用平板計(jì)數(shù)法得出相對(duì)應(yīng)菌的濃度約為106cfu/mL，試驗(yàn)以0.1mL的蒸餾水(即0%水提液)為空白對(duì)照，Nisin為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.4防腐劑對(duì)細(xì)菌的作用方式。本試驗(yàn)采用生長(zhǎng)曲線法和瓊脂塊再培養(yǎng)法來(lái)測(cè)定榆耳水提液及天然防腐劑復(fù)配液的抑菌作用方式。

1.2.4.1生長(zhǎng)曲線法。定量稱取細(xì)菌培養(yǎng)基100 mL裝入三角瓶，吸取大腸桿菌5 mL培養(yǎng)過(guò)夜，分別將含榆耳水提液10%、20% 和復(fù)配液10%、20% 轉(zhuǎn)入上述三角瓶中，震蕩搖勻10min，混合均勻后，以無(wú)菌操作取5mL混合液分別加入標(biāo)0、6、12、18、24、36、48h的7支試管中，并作空白對(duì)照，將試管置于搖床(250r/min)37℃ 震蕩培養(yǎng)，按相應(yīng)時(shí)間放入冰箱中貯存，最后用平板活菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定殘存的活菌數(shù)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制大腸桿菌指示菌的生長(zhǎng)曲線。

1.2.4.2瓊脂塊再培養(yǎng)法。將約為106cfu/mL的大腸桿菌菌懸液0.1mL涂布于含榆耳復(fù)合防腐劑的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，置37℃下培養(yǎng)24h，以無(wú)菌操作切取經(jīng)培養(yǎng)后未長(zhǎng)菌的瓊脂塊，加到裝有LB培養(yǎng)液的三角瓶中，劇烈振蕩lh后，置37℃培養(yǎng)24h，平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)培養(yǎng)前后培養(yǎng)液中的活菌數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1榆耳復(fù)合天然防腐劑的抑菌活性

供試菌均為食品中常見(jiàn)引起食物腐敗的腐敗菌，因?yàn)橐源藶閷?duì)象，具有一定的代表性。分別在各供試菌平板上牛津杯中加入復(fù)合防腐劑，100 μL/孔，以Nisin為陽(yáng)性對(duì)照、無(wú)菌水為陰性對(duì)照。在適宜溫度下培養(yǎng)24h，測(cè)定抑菌圈直徑，結(jié)果如表1。

表1　榆耳防腐劑復(fù)配液對(duì)不同菌的效價(jià)

由表1可以看出，在添加很少量天然防腐劑的復(fù)配液抑菌效果很強(qiáng)，尤其是對(duì)金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌效果高達(dá)95 IU/mL，對(duì)大腸桿菌等革蘭氏陰性菌的抑菌效果也提升至67 IU/mL以上。表明不同抑菌特性的抗菌物質(zhì)復(fù)配的復(fù)合防腐劑具有協(xié)同作用，有效擴(kuò)寬了抑菌譜，對(duì)多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌均有廣泛的抑菌效果。但對(duì)陽(yáng)性菌的抑制效果強(qiáng)于陰性菌，這可能與革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有關(guān)。Nikaido等[5]研究表明，與革蘭氏陽(yáng)性菌相比，革蘭氏陰性菌有獨(dú)特的外膜結(jié)構(gòu)，對(duì)于抑菌物質(zhì)具有一定的抵抗作用，而且不同種類的抑菌物質(zhì)對(duì)不同細(xì)菌具有不同的抑菌作用。詳細(xì)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

2.2復(fù)合防腐劑的MIC

表2　榆耳復(fù)合天然防腐劑的MIC

注：—表示未見(jiàn)菌落生長(zhǎng)；+ 表示有少量菌落生長(zhǎng)；++ 為菌落較多但少于平皿面積 1/3；+++菌落達(dá)到平皿面積 1/2 及以上。

由表2觀察可知，復(fù)合防腐劑濃度在15%時(shí)，對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)桿菌、和蠟樣芽孢桿菌菌落有少量的生長(zhǎng)，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌并未長(zhǎng)菌；然而當(dāng)復(fù)合防腐劑濃度在20%時(shí)，所有菌本未見(jiàn)生長(zhǎng)，表明復(fù)配液具有良好的抑菌活性，并得出復(fù)合防腐劑的MIC為20%。由此可見(jiàn)，復(fù)合防腐劑的濃度為20%時(shí)，能夠抑制所有細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.3榆耳復(fù)合天然防腐劑抑菌作用方式

防腐劑對(duì)微生物的作用方式有抑菌、殺菌或兼而有之。通過(guò)測(cè)定微生物生長(zhǎng)狀況，可以評(píng)價(jià)不同抗菌物質(zhì)對(duì)微生物作用的效果。通過(guò)不同培養(yǎng)時(shí)間取樣測(cè)定培養(yǎng)液中指示菌的吸光度和活菌數(shù)，可初步確定抗菌物質(zhì)對(duì)指示菌的作用方式。

2.3.1榆耳復(fù)合防腐劑對(duì)指示菌生長(zhǎng)曲線的影響。將含10%、20% 濃度的榆耳復(fù)合防腐劑與大腸桿菌在37 ℃下培養(yǎng)，在48h內(nèi)定時(shí)取樣，測(cè)吸光度繪制生長(zhǎng)曲線。如圖1可知，培養(yǎng)初期0～18h，在復(fù)合防腐劑的作用下，與正常相比，指示菌的菌數(shù)顯著降低，防腐劑抑菌情況下，菌體的吸光度值均在0.2以下，而且復(fù)合防腐劑濃度越高，菌數(shù)越少，說(shuō)明防腐劑具有很強(qiáng)的抑菌能力。培養(yǎng)后期18～48h，含復(fù)配液的樣品OD值維持在0.2以下，可以看出添加天然防腐劑的復(fù)配液抑菌作用很穩(wěn)定，而且18h之后，菌體OD值有逐漸下降的趨勢(shì)，表明菌落總數(shù)也在明顯減少，這說(shuō)明復(fù)合防腐劑不僅有抑菌作用，而且還有一定的溶菌作用。

圖1　不同濃度榆耳水提液和防腐劑復(fù)配液對(duì)

圖2　不同濃度榆耳水提液和防腐劑復(fù)配液抑菌后的活菌數(shù)

分別將含10%、20% 濃度的榆耳復(fù)合防腐劑與大腸桿菌在37℃下培養(yǎng)，在48h內(nèi)定時(shí)取樣，利用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，在10%和20%復(fù)合防腐劑的作用下，6h內(nèi)活菌數(shù)急劇下降，由106cfu/mL下降到102cfu/mL，而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，大腸桿菌的活菌數(shù)還在明顯下降，在12h以后含有20%的復(fù)配液的培養(yǎng)基幾乎沒(méi)有菌的生長(zhǎng)，這說(shuō)明復(fù)配液具有較強(qiáng)的殺菌作用。

2.3.2榆耳復(fù)合防腐劑的作用方式。通過(guò)測(cè)定活菌數(shù)，結(jié)果含有復(fù)合防腐劑的平板上含有74 cfu/mL，將未長(zhǎng)菌的瓊脂塊加入液體LB培養(yǎng)基，震蕩1h之后轉(zhuǎn)接到平板，培養(yǎng)24h后，活菌數(shù)增加到2.8×104cfu/mL。說(shuō)明經(jīng)過(guò)一定時(shí)間培養(yǎng)后，未長(zhǎng)菌的瓊脂塊仍有活菌殘留，這部分菌應(yīng)該是受到抑制。所以榆耳復(fù)合天然防腐劑對(duì)細(xì)菌的作用方式為抑菌和殺菌共有。

3結(jié)論

采用杯碟法、生長(zhǎng)曲線法及瓊脂塊再培養(yǎng)法，研究了復(fù)合防腐劑的抑菌效果及對(duì)細(xì)菌的作用方式。結(jié)果表明，復(fù)合防腐劑對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等均有良好的抑菌效果。隨著防腐劑的濃度增加，對(duì)各供試菌的抗菌活性也顯著增強(qiáng)，但不同供試菌對(duì)復(fù)合防腐劑的抗菌作用敏感性不一致。以大腸桿菌為指示菌，顯示復(fù)合防腐劑的MIC為20%。生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合防腐劑顯著抑制指示菌的生長(zhǎng)繁殖，具有較強(qiáng)的抑菌作用，在后期供試菌OD降低，表明防腐劑除了抑菌作用，還有一定的溶菌作用。進(jìn)一步考察了生長(zhǎng)過(guò)程中的活菌數(shù)，發(fā)現(xiàn)前6h活菌數(shù)顯著降低，從106降低至102cfu/mL，在12h以后含有20%的復(fù)配液的培養(yǎng)基幾乎沒(méi)有菌的生長(zhǎng)，這說(shuō)明復(fù)配液具有較強(qiáng)的殺菌作用。采用瓊脂塊再培養(yǎng)法進(jìn)一步研究防腐劑的作用方式，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)一定時(shí)間培養(yǎng)后，未長(zhǎng)菌的瓊脂塊仍有活菌殘留，這部分菌應(yīng)該是受到抑制。所以榆耳復(fù)合天然防腐劑對(duì)細(xì)菌的作用方式為抑菌和殺菌共有。

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中圖分類號(hào):TS202.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

*通訊作者：馮磊(1981—)，男，副研究員，從事非木質(zhì)林產(chǎn)品加工、保藏方面研究，E-mail: lkykjc@126.com。

基金項(xiàng)目：黑龍江省森林工業(yè)總局重點(diǎn)科研攻關(guān)項(xiàng)目(sgzjY2012008)；黑龍江省省屬科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)

收稿日期：2015-11-03

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2016.02.008