蔣景龍,李 麗,趙 樺,李新生,沈季雪,徐衛(wèi)平

(1.陜西理工學院生物科學與工程學院,陜西漢中723001；2.陜西理工學院化學與環(huán)境科學學院陜西漢中723001；3.陜西省資源生物重點實驗室,陜西漢中723001)

低溫脅迫對三種柑橘葉片抗性生理特性影響

蔣景龍1,李 麗2,趙 樺1,李新生3,沈季雪1,徐衛(wèi)平1

(1.陜西理工學院生物科學與工程學院,陜西漢中723001；2.陜西理工學院化學與環(huán)境科學學院陜西漢中723001；3.陜西省資源生物重點實驗室,陜西漢中723001)

以陜南地區(qū)的3種主栽柑橘離體葉片為材料,分別以5、0、－5和－10℃進行低溫處理,分析與耐寒性相關的生理響應,并采用隸屬函數法分析3種柑橘的抗寒能力以及通過主成分分析評價各個測定指標的貢獻率。結果表明:隨著處理溫度的降低,3種柑橘離體葉片均依次出現葉片卷曲、葉片細胞內的水分外滲,細胞內結冰導致葉片僵硬和最終的葉片內外結冰情況,葉片形態(tài)變化結果顯示3種柑橘抗寒能力強弱依次為日南1號>興津>泛亞特早。隨處理溫度的降低,3種柑橘離體葉片的相對電導率(REC)和丙二醛(MDA)均從0℃處理時呈顯著升高趨勢,－10℃處理時達到最高值,同一低溫處理條件下REC和MDA值的大小順序均為泛亞特早>興津>日南1號。O－2?、H2O2和可溶性糖含量總體保持升高的趨勢,而脯氨酸含量呈先顯著升高后降低的趨勢?？寡趸窼OD、CAT和APX的活性及抗氧化物質ASC含量均呈現先升高后下降的趨勢。REC和MDA綜合指標的累積貢獻率高于85 ,具有較強的代表性,可作為柑橘抗寒性分析的重要指標,平均隸屬度分析結果表明3種柑橘抗寒能力依次為日南1號>興津>泛亞特早。

柑橘,低溫,相對電導率,隸屬函數,脯氨酸

凍害是影響柑橘生長發(fā)育的常發(fā)性自然災害,極端地區(qū)甚至年年發(fā)生(Pietrini et al,2005)。陜西省柑橘種植主要分布在陜西南部的漢中、安康和商洛地區(qū),栽培歷史悠久,是陜南地區(qū)農業(yè)的主導產業(yè)之一。然而,陜南地區(qū)地處亞熱帶的北緣,也是中國柑橘種植的最北緣,凍害的多發(fā)地帶。近幾年陜南柑橘連續(xù)遭受周期性大面積凍害。2012－2013年陜南地區(qū)發(fā)生三十年一遇的持續(xù)低溫天氣,柑橘受凍面積占全省柑橘總種植面積的1/4,漢中主產區(qū)柑橘受災尤為嚴重(李新生等,2014)。影響柑橘凍害發(fā)生的因素有很多方面,如地理緯度、海拔高度、氣候變化等外界環(huán)境因素和柑橘品種、砧木、嫁接方式等自身因素(李新生等,2014)。低溫凍害與低溫強度呈指數關系,隨低溫強度的增大,凍害率呈增加趨勢(朱海濤等,2012)。低溫脅迫影響柑橘正常的生長發(fā)育及生理生化指標,同時啟動低溫馴化相關的基因表達和信號傳導途徑(陳志遠等,2014)。李衛(wèi)等(1998)的研究表明離體原生質體抗寒性與田間植株的春梢中部的正常葉片抗寒性之間有顯著的正相關。周曉音等(2010)選擇6個柑橘品種的完整植株進行低溫處理,表明宮川和溫州蜜柑較其它柑橘品種對低溫的耐性較強。馬文濤和樊衛(wèi)國(2014)對貴州3個野生柑橘種類宜昌橙、酸橙、白黎檬和栽培品種默科特,進行一系列低溫冷凍處理24 h后檢測MDA含量、可溶性糖、可溶性蛋白和POD和SOD活性等生理指標,認為抗寒性強的柑橘枝條有更強的抗氧化脅迫能力和滲透調節(jié)能力。

柑橘葉片的原生質體、新稍、整個植株和枝條均被用作試驗材料進行相關研究,而利用柑橘離體葉片進行低溫脅迫相關研究則尚未見報道。葉片是植物進行光合作用和呼吸的主要器官,同時也是凍害最容易侵襲的部位。重凍時,柑橘葉片呈桶狀卷曲,很快萎凋干枯,落葉嚴重,光合作用停止,輕凍時可使柑橘葉片表皮細胞受害,蒸騰作用加強,葉片慢慢卷縮或部分落葉,光合作用減弱。本研究以陜南地區(qū)引種的抗凍性較強品種日南1號和興津及本地培育并推廣種植的抗凍性相對較差品種泛亞特早的離體葉片為材料,分析5、0、－5、－10℃低溫脅迫下柑橘離體葉片中與抗寒性相關的生理指標,并采用隸屬函數法對其抗寒性進行綜合評價,結果表明3種柑橘抗寒能力依次為日南1號>興津>泛亞特早與生產實踐中抗寒能力相一致。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)與低溫脅迫處理

本研究用興津(Okitsu)、日南1號(Nichinan 1)和泛亞特早(Fanyatezao)3個品種均由漢中泛亞綠色食品有限公司苗圃基地提供,3種柑橘苗均為1年生發(fā)育良好的嫁接苗(砧木為枸橘,穗木為3種多年生的穗條)。將3種盆栽橘苗在人工氣候培養(yǎng)箱內預培養(yǎng)2周,溫度為25℃/18℃(晝/夜),空氣相對濕度為80 ,光照時間為16 h/8 h(晝/夜),光照強度為4 000 lx。2周后選取生長一致橘苗,摘取植株中部健康且大小一致的柑橘葉片,分別置于5、0、－5、－10℃的冰箱低溫脅迫12 h,以25℃/18℃(晝/夜)人工氣候培養(yǎng)箱培養(yǎng)的柑橘離體葉片為對照(CK),處理溫度誤差為±0.5℃。處理后的樣品分別進行各種生理指標的測定,所有指標均設置3個重復。將3種柑橘對照組和5、0、－5、－10℃低溫處理的離體葉片進行拍照,比較低溫脅迫下葉片的形態(tài)變化。

1.2 生理指標測定

相對電導率(REC)測定參照令凡等(2015)的方法；可溶性糖、脯氨酸、抗壞血酸(ASC)含量測定均參照李玲等(2009)的方法；丙二醛(MDA)含量測定參照Farooq et al(2009)的方法；過氧化氫(H2O2)和超氧陰離子(O－2?)含量測定均參照Jiang et al (2012,2013)的方法；SOD、CAT和APX活性的檢測均參照蔣景龍等(2014)的方法。

1.3 隸屬函數與各單項指標的主成分分析

各指標的隸屬函數分析參照孟艷瓊等(2009)和司劍華和盧素錦(2010)的方法。參考廖景容(2005)的方法,隸屬度按5級制劃分標準:隸屬度≥0.7為強抗(Ⅰ級)；隸屬度≥0.6為抗(Ⅱ級)；隸屬度≥0.4為中抗(Ⅲ級)；隸屬度≥0.3為弱抗(Ⅳ級)；隸屬度<0.3為不抗(Ⅴ級)?？购禂? )＝低溫脅迫后指標測定值/對照組指標測定值× 100 ,各單項指標的主成分分析參照劉杜玲等(2015)的方法。

1.4 數據分析

用Excel 2007、Origin7.5 SR1和SPSS16.0軟件進行制圖和統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 不同低溫脅迫下3種柑橘離體葉片的形態(tài)變化

如圖1所示,與對照組相比,在5℃處理時,3種柑橘葉片均有些卷曲,但卷曲程度有差別,日南1號卷曲較輕,興津其次,泛亞特早卷曲嚴重(圖1:A,B,C)。當處理溫度降為0℃處理時,3種柑橘葉片均有少量水分析出,其中泛亞特早水分析出最多,日南1號最少,興津居中(圖1:G,H,I)。隨著溫度繼續(xù)下降至－5℃,葉片中細胞開始結冰導致葉片僵硬,其中泛亞特早最為明顯,而興津其次,日南1號較輕(圖1:G,K,L)。在－10℃處理時3種柑橘葉片表現出了細胞內外結冰情況,其中泛亞特早葉片不僅表現出僵硬而且葉片外面結冰嚴重,興津葉片雖然僵硬加劇但細胞外結冰相對泛亞特早較少,日南1號葉片細胞內也嚴重結冰,但未發(fā)現細胞外結冰情況(圖1:M,N,O)。以上3種柑橘葉片在不同低溫脅迫下的形態(tài)變化表明,日南1號抗凍性較強,興津其次,泛亞特早最弱。

2.2 葉片REC和MDA含量的變化

由圖2可知,與對照組相比0℃處理時3種柑橘REC均顯著性升高,表明葉片細胞膜系統(tǒng)開始受到破壞。－5℃處理時,泛亞特早、興津和日南1號REC分別較對照組顯著增加58.14 、39.98 和19.27 ,表明此時膜系統(tǒng)傷害較重。－10℃處理時,3種柑橘REC達到最高值,表明膜系統(tǒng)受到嚴重破壞。泛亞特早REC增幅較同溫度處理的興津和日南1號高,表明泛亞特早膜系統(tǒng)破壞程度較其他2個品種嚴重。3種柑橘離體葉片的MDA含量隨著溫度降低均呈逐漸增加的趨勢,其中泛亞特早和興津MDA含量在0℃處理時開始較對照組顯著增加,而日南1號MDA含量在－5℃處理時開始較對照組顯著增加,均在－10℃處理時達最大值。從總體趨勢看,隨著處理溫度降低,3種柑橘離體葉片的REC和MDA含量均呈現逐漸升高的趨勢。

2.3 H2O2和O－2?含量的變化

圖3顯示,與對照組相比,泛亞特早的H2O2含量在5℃處理時開始顯著升高,興津和日南1號的H2O2含量則在－5℃處理時開始顯著升高,而且泛亞特早的H2O2含量均較同期其他2個品種H2O2含量的增加幅度大。興津和泛亞特早的O－2?含量在0℃處理時開始顯著升高,并隨處理溫度的降低呈逐漸增加的趨勢；而日南1號的O－2?含量在－5℃處理時開始顯著升高,－10℃處理時較－5℃處理時O－2?含量有顯著下降,但和對照組無顯著性差異。從總體趨勢看,隨著處理溫度的降低,3種柑橘離體葉片的H2O2和O－2?含量均呈現逐漸升高的趨勢。

2.4 滲透調節(jié)物質的變化

圖4顯示,5℃處理時,3種柑橘離體葉片脯氨酸含量與對照組相比無顯著變化；0℃處理時日南1號和興津的脯氨酸含量明顯升高,而泛亞特早則無顯著變化；－5℃處理時,3種柑橘脯氨酸含量較對照組均顯著增加,且均達到最大值。－10℃處理時,日南1號和興津的脯氨酸含量較對照組顯著升高,但興津的脯氨酸較－5℃處理時顯著降低,而日南1號的脯氨酸含量較－5℃處理時無顯著差異；泛亞特早脯氨酸含量較－5℃處理時顯著降低。3種柑橘離體葉片的可溶性糖含量均在處理溫度為0℃時與對照組相比開始顯著性升高,－10℃處理時其含量達到最高值。總體分析顯示,隨著處理溫度的降低,3種柑橘離體葉片的脯氨酸含量均呈現先升高后降低的趨勢,而可溶性糖則呈現逐漸升高的趨勢。

2.5 抗氧化系統(tǒng)的變化

圖5顯示,與對照組相比,興津和日南1號SOD活性在5℃處理時開始顯著升高,泛亞特早SOD活性在0℃處理時開始顯著升高；興津和泛亞特早SOD活性在0℃處理時達到峰值,在－5℃和－10℃處理時SOD活性較0℃處理時顯著下降,但興津SOD活性較對照組差異不顯著,而泛亞特早SOD活性較對照組顯著降低；日南1號SOD活性在－10℃處理時較－5℃處理時顯著下降,但仍顯著高于對照組。隨處理溫度的降低,5℃處理時葉片的CAT活性均較對照組顯著升高；0℃處理時CAT活性均達到峰值；－5℃和－10℃處理時CAT活性均較0℃處理時顯著下降,但興津和泛亞特早CAT活性和對照組無顯著性差異,而日南1號CAT活性仍顯著高于對照組。APX活性在0℃處理時達到峰值,－5℃和－10℃處理時較0℃處理時顯著下降。與對照組相比,興津和日南1號APX活性在5℃處理時開始顯著升高,而泛亞特早APX活性在0℃處理時開始顯著升高；－5℃和－10℃處理時,興津APX活性無顯著性差異,而日南1號APX活性仍顯著高于對照組；泛亞特早APX活性在－5℃處理時和對照組無顯著差異,但在－10℃處理時較對照組顯著降低。隨處理溫度降低,ASC含量在－5℃處理時達到峰值,－10℃處理時顯著下降,但均顯著高于對照組。興津和泛亞特早ASC含量在0℃處理時開始顯著升高,而日南1號ASC含量在5℃處理時開始顯著升高。從總體趨勢看,隨著處理溫度的降低,3種柑橘離體葉片的3種酶SOD、CAT、APX活性和ASC均呈現先升高后降低的趨勢。尤其在研究多年生木本植物逆境條件下的生理生化變化方面。離體葉片與活體或連體葉片生理生化變化是否具有一致性方面的研究較少。曾小美等(2002)通過檢測擬南芥連體和離體葉片光合作用發(fā)現測得的光響應結果是一致的。張穎等(2011)經過反復實驗,發(fā)現在人工控制條件下生長部位一致、年齡相同的離體葉片葉綠素含量、膜透性和細胞生長狀況等生理特性在同一基因型內的變化很小,可以準確鑒定楊樹的耐鹽潛力。而李自龍等(2014)和令凡等(2015)僅采用不同品種油橄欖的離體葉片分別研究滲透脅迫和低溫脅迫下的生理響應,但未檢測活體葉片生理變化規(guī)律。關于低溫脅迫下柑橘離體葉片與活體葉片之間生理生化變化是否具有一致性尚未見相關研究報道。該研究選擇抗凍性較強的日南1號和興津作為材料與本地早熟品種泛亞特早進行低溫脅迫下生理生化比較。隨處理溫度的降低,3種柑橘離體葉片均依次出現葉片卷曲,葉片細胞內的水分外滲,細胞內結冰導致葉片僵硬和最終的葉片內外結冰情況。一般5℃和0℃處理的柑橘處于寒害階段,此時生長受到抑制,代謝減弱,葉片會發(fā)生輕微卷曲,嚴重者出現輕微水分外

圖1 不同低溫脅迫下3種柑橘葉片形態(tài)變化 A,D,G,J,M.興津品種葉片；B,E,H,K,N.日南1號品種葉片；C,F,I,L,O.泛亞品種葉片；A,B,C.對照組葉片；D,E,F.5℃處理葉片；G,H,I.0℃處理葉片；J,K,L.－5℃處理葉片；M,N,O.－10℃處理葉片。Fig.1 Changes of morphology in detached leaves of three cultured varieties of Citrus under different low temperature stresses A,D,G,J,M.Leaves of Okitsu；B,E,H,K,N.Leaves of Nichinan 1；C,F,I,L,O.Leaves of Fanyatezao；A,B,C.Leaves of control group；D,E,F.Leaves of 5℃treated group；G,H,I.Leaves of 0℃treated group；J,K,L.Leaves of－5℃treated group；M,N,O.Leaves of－10℃treated group.

圖2 不同低溫脅迫下柑橘離體葉片REC和MDA含量的變化Fig.2 Changes of REC and MDA contents in detached leaves of Citrus under different low temperature stresses

圖3 不同低溫脅迫下柑橘離體葉片H2O2和O－2?含量的變化 不同字母表示處理溫度間在0.05水平存在顯著性差異。下同。Fig.3 Changes of H2O2and O－2?contents in detached leaves of Citrus under different low temperature stresses Different normal letters indicate significant differences among treatments with different temperatures at 0.05 level.The same below.

圖4 不同低溫脅迫下柑橘離體葉片脯氨酸和可溶性糖含量的變化Fig.4 Changes of proline and soluble sugar contents in detached leaves of Citrus under different low temperature stresses

圖5 不同低溫脅迫下柑橘離體葉片抗氧化系統(tǒng)的變化Fig.5 Effects of different low temperature stresses on proline and soluble sugar contents in detached leaves of Citrus

2.6 隸屬函數與各單項指標的主成分分析

3種柑橘抗寒性生理指標隸屬函數值及綜合分析見表1。平均隸屬度反映了品種抗寒能力的大小,其值越大則抗寒性越強,3種柑橘的抗寒性表現為日南1號>興津>泛亞特早。根據廖景容等(2005)的隸屬度5級制劃分標準,3種柑橘抗寒性生理指標平均隸屬度均在0.4～0.6之間,抗寒性屬于中抗等級。對3種柑橘的10項生理指標的抗寒系數進行主成分分析,相對電導率和丙二醛的綜合指標的貢獻率分別為74.882 和22.032 ,一般累積貢獻率大于85 具有較強的代表性,這兩個指標基本上包括了10個生理指標所代表的全部信息,可以用這兩個指標進行柑橘的抗寒性分析。

3 討論

以離體材料(如離體葉片、枝條、新稍、原生質體等)和實驗模型開展逆境脅迫研究的報道很多,滲,這與該研究中的結果相一致,當溫度降低為－5℃和－10℃時,柑橘則分別受到2級凍害和5級凍害,此時葉片將出現細胞結冰,長時間凍害將導致葉片變黃枯萎脫落。該研究在－5℃和－10℃處理時均出現了葉片僵硬,葉片外結冰的情況符合凍害的特征。但在低溫處理過程中3種柑橘從葉片形態(tài)變化上表現明顯的差異性,泛亞特早在受到凍害時細胞內外均出現嚴重結冰狀況,表現出相對較弱的抗凍能力,而日南1號僅表現為細胞內結冰。根據REC增幅超過50 來確定半致死溫度分析,3種柑橘REC增幅超過50 時的溫度分別為泛亞特早－5℃,興津在－10℃,而日南1號雖顯著升高但均沒有超過50 ,表明日南1號的抗寒性較其他2個品種強。隨著溫度降低,3種柑橘葉片中MDA的相對增幅表現為日南1號<興津<泛亞特早,表明日南1號遭受低溫傷害的程度小。REC和MDA均與植物的抗寒性呈負相關,大多數植物在低溫脅迫下REC和MDA含量升高(徐維杰等,2013；吳廣霞等,2008；李冬花等,2014)。低溫脅迫破壞了ROS代謝平衡導致ROS大量積累,較高濃度則會對植物體造成傷害(張夢如等,2014)。隨溫度的降低,3種柑橘離體葉片的O－2?和H2O2含量一直呈逐漸增加趨勢,在0℃處理時葉片細胞內開始積累O－2?和H2O2,當溫度降至－5℃和－10℃時積累了過量的活性氧,加劇了膜脂過氧化作用。日南1號和興津的H2O2含量在－5℃處理時開始顯著升高而泛亞特早在5℃處理時就開始顯著升高且泛亞特早的H2O2含量均較同期日南1號和興津的增加幅度大,O－2?和H2O2的變化趨勢相似,這些表明低溫脅迫下日南1號和興津葉片受到的傷害較泛亞特早輕。

表1 低溫脅迫下柑橘各指標隸屬函數值及各綜合指標的系數及貢獻率Table 1 Subordinate function values and coefficient of comprehensive indexes and their contribution rates of Citrus under low temperature stress

脯氨酸和可溶性糖作為滲透調節(jié)物質對維持膜的完整性及提高植物的抗逆性具有重要的意義(馬正華等,2009)。結果表明隨溫度的降低,3種柑橘離體葉片中脯氨酸積累均呈先升后降的趨勢,而可溶性糖含量則呈現一直升高的趨勢。這些表明,這兩種滲透調節(jié)物質在抵抗柑橘的低溫脅迫過程中可能存在不同的機制。在低溫脅迫過程中,盡管3種柑橘滲透調節(jié)物質的變化趨勢一致,但日南1號葉片中的兩種滲透調節(jié)物質的積累均明顯高于泛亞特早和興津。SOD、CAT和APX是植物體內清除自由基的重要保護酶,能清除植物體內的O－2?和H2O2(Matysik et al,2002)。3種柑橘離體葉片中SOD、CAT和APX活性以及ASC含量變化顯示,5℃和0℃處理導致了抗氧化酶活性上升,表明輕度的低溫脅迫提高了柑橘的ROS清除能力,增強了抗氧化酶的活性,但當溫度降至－5℃和－10℃時,嚴重的低溫脅迫超出了抗氧化系統(tǒng)自我調節(jié)的范圍,抗氧化系統(tǒng)又表現出了明顯的下降趨勢。由圖4可以看出,日南1號和興津的抗氧化酶活性和抗氧化物質含量始終高于泛亞特早,這表明活性氧的清除能力也是抗寒能力的重要參數。

平均隸屬度分析結果表明日南1號抗寒能力較泛亞特早和興津強,可作為陜南地區(qū)柑橘種植的主栽品種,這也與生產實踐中這兩個品種具有較強抗凍性一致。對3種柑橘的10項生理指標的抗寒系數進行主成分分析,相對電導率和丙二醛的綜合指標的累積貢獻率大于85 ,具有較強的代表性,可以作為柑橘的抗寒性分析的重要指標。

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Low temperature stress affected physiological characters in three varieties of Citrus leaves

JIANG Jing-Long1,LI Li2,ZHAO Hua1,LI Xin-Sheng3,SHEN Ji-Xue1,XU Wei-Ping1

(1.School of Biological Science and Engineering,Shaanxi University of Technology,Hanzhong 723001,China；2.Chemical and Environmental Sciences,Shaanxi University of Technology,Hanzhong 723001,China；3.Shaanxi Key Laboratory of Bio-resources,Hanzhong 723001,China)

Three cultivars of Citrus planted in the southern area of Shaanxi Province were used as experimental materi-als,and their detached leaves were treated at 5℃,0℃,－5℃and－10℃to analyze the physiological responses relat-ed with cold hardiness of Citrus under low temperature stress.Meanwhile the method of subordinate function was used to compare the cold resistance abilities of Citrus and measure parameter and their contribution rate were analyzed by using principal components analysis.The results showed that three varieties of Citrus leaves in vitro were successively appear leaf curl,water leakage inside the leaf cells,intracellular freezing and eventually lead to stiff blades and external icing with the processing temperature decreases.Changes results of leaf morphology showed that the order of cold tolerance in three varieties of Citrus was Nichinan 1>Okitsu>Fanyatezao.The relative electric conductivity(REC)and malondialde- hyde(MDA)of detached leaf all increased obviously under the temperature of 0℃and reached the max value upon the temperature of－10℃in three varieties of Citrus as temperature decreased.REC and MDA value at the same low tem-perature conditions was the order of Fanyatezao>Okitsu>Nichinan 1.The content of O－2?,H2O2and soluble sugar all kept the overall rising trend and proline significantly increased after the first decreased.The activities of SOD,CAT and APX as well as the content of ASC generally increased first and then decreased.The results showed that the cumulative contribution of REC and MDA composite indicator was higher than 85 and had strong representation as citrus cold analysis of key indicators.The results identified by the average degree of membership hardiness indicated that the order of cold tolerance in three varieties of Citrus was Nichinan 1>Okitsu>Fanyatezao.

Citrus,low temperature,relative electric conductivity,subordinate function,proline

Q945.78

A

1000-3142(2016)02-0208-08

10.11931/guihaia.gxzw201507029

蔣景龍,李麗,趙樺,等.低溫脅迫對三種柑橘葉片抗性生理特性影響[J].廣西植物,2016,36(2):208－215

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2015-07-27

2015-12-07

陜西省自然科學基金(2014JQ3113)；陜西省教育廳自然科學基金(14JK1158)；陜西理工學院科研基金(SLGKY15-41)[Supported by the Natural Science Foundation Research Project of Shaanxi Province(2014JQ3113)；Natural Science Research Project in Shaanxi Province Department of Education(14JK1158)；Scientific Research Fund from Shaanxi University of Technology(SLGKY15-41)]。

蔣景龍(1980-),男,山東棗莊人,博士,講師,碩士生導師,主要從事逆境植物學研究,(E-mail)jiangjinglong511＠163.com。