鄭保平，韓立民，林唐唐，韓　露，唐　楊，劉　真，孫小勇，吳　斌，劉海華，劉金明

(1．贛南醫(yī)學(xué)院a．第一附屬醫(yī)院，江西　贛州　341000; 2．江西中醫(yī)藥大學(xué)人文學(xué)院，江西　南昌　330004)

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化痰法為指導(dǎo)的白芥子相關(guān)藥組對肝纖維化大鼠VEGF、bFGF表達(dá)的影響*

鄭保平1a，韓立民1，林唐唐1a，韓露2，唐楊1a，劉真1a，孫小勇1a，吳斌1a，劉海華1a，劉金明1a

(1．贛南醫(yī)學(xué)院a．第一附屬醫(yī)院，江西贛州341000; 2．江西中醫(yī)藥大學(xué)人文學(xué)院，江西南昌330004)

摘要:目的:對白芥子及其藥組對實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠VEGF、bFGF、CoⅣ、LN的影響進(jìn)行研究。方法:60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白對照組、模型組、陽性對照組、白芥子組、白芥子+丹參組、白芥子+黃芪組。除空白對照組外，其余各組均采用大鼠背部皮下注射50%CCl40．1 mL·100 g(－1)，2次·周(－1)，連續(xù)造模12周。陽性對照組、白芥子組、白芥子+丹參組、白芥子+黃芪組于造模的第7周開始給藥，陽性對照組給予秋水仙堿0．4 mg· kg(－1)，白芥子組、白芥子+丹參組、白芥子+黃芪組的劑量分別為1．0 g·kg(－1)，共7周。采用放射免疫分析法檢測肝組織勻漿CoⅣ、LN，免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠肝組織VEGF、bFGF蛋白的表達(dá)。結(jié)果:模型組與正常組比較: CoⅣ、LN顯著增高(P＜0．01)，VEGF、bFGF蛋白的表達(dá)顯著增高(P＜0．05) ;白芥子組、白芥子+丹參組、白芥子+黃芪組與模型組比較: CoⅣ、LN顯著減低(P＜0．05)，VEGF、bFGF蛋白的表達(dá)顯著減低(P＜0．05)。結(jié)論:以化痰理論為指導(dǎo)的白芥子及其藥物組合對肝纖維化大鼠有一定的防治作用，其機(jī)制可能與影響VEGF、bFGF蛋白的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞:肝纖維化;白芥子; VEGF; bFGF

近年來，抗肝纖維化治療的研究雖然取得了一定進(jìn)展，但由于對這種多因素、多環(huán)節(jié)、多階段的復(fù)雜發(fā)病機(jī)制遠(yuǎn)未了解清楚，致使肝纖維化的治療尚未取得顯著性突破。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肝纖維化病程遷延，一者耗氣傷陰，致使津液運(yùn)無力，停積不化，為瘀、為痰;二者犯肝累脾久則及腎，統(tǒng)藏失節(jié)，化瘀、化痰。痰瘀互結(jié)，痰因瘀阻其凝更固，瘀因痰附其阻愈牢;遂成“痰夾瘀血，遂生窠囊”之頑癥。因此從“痰”著眼，對化痰中藥進(jìn)行抗肝纖維化的研究很有必要。鑒于白芥子性味“辛溫”，入肝、脾、肺、胃、心與胞絡(luò)之經(jīng)(《本草新編》)，“味辛能散，性溫能行”，能“通經(jīng)絡(luò)”(《得配本草》)，治脅下及皮里膜外之痰(《本草求真》)，有搜剔宣通之功，又不耗損肺、胃、肝、心之氣，入于氣分而實(shí)宜，即用于血分而亦當(dāng)者也”(《本草新編》)的特點(diǎn)［1］，我們在文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上就白芥子相關(guān)藥組對肝纖維化大鼠VEGF、bFGF的影響進(jìn)行了研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1．1材料雄性SD大鼠60只，體重150～210 g，由贛南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。白芥子及丹參、黃芪(由贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥房提供(比例為1∶1) ;秋水仙堿(colchicine，Col)為昆明股份制藥有限公司產(chǎn)品;四氯化碳(CCl4)為北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司產(chǎn)品;層黏連蛋白(laminin，LN)、IV型膠原(collagen type IV，IV-C)放射免疫分析測定盒均為上海海軍醫(yī)學(xué)研究所生物技術(shù)中心產(chǎn)品;鼠抗bFGF單克隆抗體，兔抗VEGF多克隆抗體，兔SPkit及DAB等均購自武漢博士的有限公司。

1．2方法

1．2．1模型制備及給藥60只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體重隨機(jī)分為空白對照組、模型組、秋水仙堿對照組、白芥子組、白芥子+丹參組、白芥子+黃芪組，共6組，每組10只大鼠。除空白對照組注射等量的生理鹽水外，其它組均背部皮下注射50% CCl40．1 mL·100 g－1，2次·周－1，連續(xù)造模12周。造模第7周開始，空白對照組和模型組灌胃蒸餾水，秋水仙堿組以0．4 mg·kg－1，白芥子組、白芥子+丹參組、白芥子+黃芪組均為1．0 g·kg－1(體重)，按2 mL·100 g－1，每日分2次，連續(xù)灌胃7周［2］。

1．2．2標(biāo)本采集及處理末次造模48 h時(shí)后，采用頸椎脫臼處死大鼠，取肝左葉相同部位組織于10%中性緩沖福爾馬林溶液中固定，常規(guī)取材、脫水、包埋，按照免疫試劑盒說明操作以檢測VEGF、bFGF，以PBS代替一抗作陰性對照。其余肝組織稱重后用生理鹽水制備5%的勻漿，2 000 r·min－1離心10 min取上清液，采用放射免疫法檢測肝組織勻漿CoⅣ、LN。

1．2．3結(jié)果判定VEGF、bFGF以胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。①先按染色強(qiáng)度打分:無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分;②再按陽性細(xì)胞百分比打分:陰性為0分，小于10% 為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，75%以上為4分。將①②兩者的積分相乘，總分0 ～1分(－)，2～3分(+ )，4～5分(+ + )，6～7分(+ + + )。

1．2．4統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量指標(biāo)的數(shù)據(jù)資料以±s表示，各組間測定指標(biāo)的總體比較采用單因素方差分析;計(jì)數(shù)資料進(jìn)行Ridit分析［3］，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2．1白芥子及其藥組對肝纖維化大鼠模型肝組織勻漿CoⅣ、LN含量的影響模型組與正常組比較CoⅣ、LN顯著增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01) ;陽性對照組與模型組比較CoⅣ、LN顯著減低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05) ;白芥子組、白芥子+丹參組、白芥子+黃芪組與模型組比較CoⅣ、LN顯著減低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。結(jié)果見表1。

表1化痰法對肝纖維化模型大鼠肝組織勻漿CoⅣ、LN的影響/±s，ng·mL－1

表1化痰法對肝纖維化模型大鼠肝組織勻漿CoⅣ、LN的影響/±s，ng·mL－1

注:與正常組比較，△P＜0．01;與模型組比較，* P＜0．05。

組別　　動物數(shù)LN　CoIV正常對照組10　 58．96±14．02　 25．07±10．6模型對照組　10　 115．01±20．47△57．42±13．21陽性對照組　10　 100．28±22．35*46．72±11．92*白芥子組　10　 97．01±17．97*46．66±8．99*白芥子+丹參組　9　 93．34±16．73*43．23±7．92*白芥子+黃芪組　10　 95．76±19．33*44．72±9．63*△

2．2白芥子及其藥組對肝纖維化大鼠模型肝組織VEGF、bFGF的影響模型組與正常組比較VEGF、bFGF顯著增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01) ;陽性對照組與模型組比較VEGF、bFGF無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;白芥子組、白芥子+丹參組、白芥子+黃芪組與模型組比較VEGF、bFGF顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。結(jié)果見表2。

表2化痰法對肝纖維化模型大鼠肝組織VEGF、bFGF的影響/±s

注:與正常組比較，△P＜0．05;與模型組比較，※P＜0．05。

組別　　動物數(shù)　VEGF bFGF－　+　 + +　 + + +正常對照組－　+　 + +　 + + + 10　 9　 1　 0　 0　 10　 0　 0　 0模型對照組△　10　 0　 2　 5　 2　 0　 3　 4　 3陽性對照組　10　 0　 3　 6　 1　 0　 2　 6　 2白芥子組※　10　 1　 5　 4　 0　 1　 4　 4　 1白芥子+丹參組※　9　 1　 5　 2　 1　 1　 3　 5　 0白芥子+黃芪組※10　 1　 6　 3　 0　 1　 5　 4　 0

3　討論

肝纖維化是慢性肝病演變?yōu)楦斡不谋亟?jīng)階段，肝細(xì)胞損傷后以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成增多，降解相對不足，沉積在肝內(nèi)引起纖維化。HSC的激活是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，而細(xì)胞因子在HSC的激活、調(diào)節(jié)ECM生成方面發(fā)揮著重要作用，是近年來抗肝纖維化的研究熱點(diǎn)。bFGF主要由肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮和肝細(xì)胞等分泌，是成纖維細(xì)胞生長因子家族中的一員，是一個(gè)重要的有絲分裂原和血管生成因子。在肝病的早期階段，由于肝組織發(fā)生微循環(huán)障礙而合成bFGF增加，刺激內(nèi)皮細(xì)胞增生［4］。在肝病的中后期，bFGF在肝血管間隔及肝竇壁表達(dá)逐漸增強(qiáng)的同時(shí)，尚伴隨α-SMA、FN、LN、ColV等強(qiáng)表達(dá)，表明bFGF另一個(gè)重要功能是促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的產(chǎn)生［5］。因此bFGF一方面直接參與了肝纖維化的形成，同時(shí)又為其他細(xì)胞因子在肝組織局部發(fā)揮作用創(chuàng)造了條件［5］。本研究顯示模型組大鼠bFGF顯著增高，亦說明其參與了肝纖維的形成和發(fā)展，而白芥子相關(guān)藥組干預(yù)后大鼠肝組織中的bFGF及CoⅣ、LN均顯著下降，與模型組相比有顯著差異(P﹤0．05)，說明白芥子及其相關(guān)藥組可能是通過抑制bFGF的合成和分泌，一方面抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷移及分化，影響新血管的生成，干擾肝竇毛細(xì)血管化的形成。另一方面，通過影響CoⅣ、LN的合成而起到抗肝纖維化作用的。

在肝纖維化發(fā)展過程中，新生血管化顯著增高［6－7］。而具有血管生成抑制劑活性的藥物，可抑制實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的進(jìn)展［8］，表明血管發(fā)生在肝纖維化的發(fā)展過程中起著重要作用。血管生成促進(jìn)因子與血管生成抑制因子之間的平衡調(diào)節(jié)著血管形成。正常肝組織VEGF及其受體表達(dá)量極低，在肝纖維化發(fā)展過程中VEGF及其受體表達(dá)均顯著增高。研究發(fā)現(xiàn)VEGF參與了肝竇毛細(xì)血管的形成［9］。本研究顯示白芥子及其藥組對肝纖維化大鼠模型進(jìn)行干預(yù)后，肝組織中VEGF的表達(dá)明顯下降，與模型組有顯著差異(P﹤0．05)，說明白芥子相關(guān)藥組可能通過抑制VEGF的合成和分泌，進(jìn)而阻斷肝竇毛細(xì)血管化的形成而起到抗肝纖維化作用的。

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Effects of Semen Sinapis Albae Related Medicine Groups on the Expression of VEGF and bFGF in Rats with Hepatic Fibrosis under the Guidance of Resolving Phlegm

ZHENG Bao-ping1，HAN Li-min2，LIN Tang-tang1，HAN Lu3，TANG Yang1，LIU Zhen1，SUN Xiao-yong1，WU Bin1，LIU Hai-hua1，LIU Jin-ming1
(1．The First Affiliated Hospital of Gannan Medical University; 2．Gannan Medical University，Ganzhou，Jiangxi 341000; 3．College of humanities，Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang，Jiangxi 330004)

Abstract:Objective: To study the effects of semen sinapis albae related medicine groups on VEGF，bFGF，CoⅣand LN in rats with hepatic fibrosis．Methods: 60 male SD rats were randomly divided into blank control group，model group，positive control group，semen sinapis albae group，semen sinapis albae and salvia miltiorrhiza group，semen sinapis albae and astragalus membranaceus group．Rats of all groups except the control group were modeled by hypodermic injection of 0．1 mL·100 g(－1)50%CCl4twice per week for 12 weeks continuously．The positive control group，semen sinapis albae group，semen sinapis albae and salvia miltiorrhiza group，semen sinapis albae and astragalus membranaceus group were given medicine at the beginning of the seventh week; the positive control group was given colchicine 0．4 mg·kg(－1); semen sinapis albaegroup，semen sinapis albae and salvia miltiorrhiza group，semen sinapis albae and astragalus membranaceus group were given corresponding medicines 1．0 g·kg(－1)，7 weeks in all．Radioimmunoassay method was adopted to detect the level of CoⅣand LN in the liver homogenate．Immunohistochemical method was employed to detect the expression of VEGF and bFGF in liver tissues of rats in each group．Results: Compared with the normal group，the level of Cobook=18,ebook=25Ⅳand LN in the model group were significantly increased (P＜0．01)，and the expression of VEGF and bFGF were significantly increased(P＜0．05)．Compared with the model group，the level of CoⅣand LN in the semen sinapis albae group，semen sinapis albae and salvia miltiorrhiza group，semen sinapis albae and astragalus membranaceus group were significantly reduced(P＜0．05)，and the expression of VEGF and bFGF were significantly reduced(P＜0．05)．Conclusion: The semen sinapis albae related medicine groups under the guidance of resolving phlegm have a certain preventive and therapeutic effect on hepatic fibrosis rats．The mechanism may be related to the expression of VEGF and bFGF．

Key words:hepatic fibrosis; semen sinapis albae; VEGF; bFGF

(收稿日期:2015－12－03) (責(zé)任編輯:敖慧斌)

*基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(NO: 81460707) ;江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研基金(NO: 2012A050) ;贛南醫(yī)學(xué)院重點(diǎn)項(xiàng)目(NO: ZD201203)

DOI:10．3969/j．issn．1001－5779．2016．01．004

中圖分類號:R285．5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1001－5779(2016) 01－0017－04