黃仁杰 鄢雪梨 陳虎彪

[摘要]為了提高蛇葡萄素的溶解性和抗腫瘤活性，以普朗尼克F127和Dα維生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯為復(fù)合載體材料，采用薄膜水化法制備蛇葡萄素納米膠束，考察蛇葡萄素納米膠束的最佳工藝條件和理化參數(shù)。采用MTT法，比較原料及納米膠束制劑對MCF7細胞增殖的抑制作用。結(jié)果表明，蛇葡萄素納米膠束平均粒徑為（226±05） nm，包封率為（8042±113）%，載藥量為（441±026）%。所制得的蛇葡萄素混合納米膠束比蛇葡萄素原料的溶解度增加16倍，且在不同釋放介質(zhì)中8 h可累積釋放藥物90%以上，并能夠顯著抑制MCF7細胞的增殖（P<001）。該混合納米膠束可作為蛇葡萄素新的藥物傳遞系統(tǒng)。

[關(guān)鍵詞]蛇葡萄素；納米膠束；普朗尼克F127；Dα維生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯；薄膜水化法；抗腫瘤

蛇葡萄素（ampelopsin）又名二氫楊梅素，系藤茶的最主要活性成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，蛇葡萄素具有抑菌[1]、抗腫瘤[25]、抗炎鎮(zhèn)痛、降血脂、抗氧化[6]等作用，因此極具開發(fā)潛力。但蛇葡萄素水溶性差，生物半衰期短[78]，從而影響其在體內(nèi)的生物利用度。有研究報道通過將蛇葡萄素制備成固體分散體、環(huán)糊精包合物等來提高其溶解度，但存在載藥量低、增溶倍數(shù)低[9]，且不能達到延長體內(nèi)生物半衰期的目的。

納米膠束作為新的藥物載體是解決上述問題的有效手段，其不但可以提高藥物的水溶性，還可以降低藥物被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)識別和攝取的機會達到體內(nèi)長循環(huán)，通過增強滲透滯留效應(yīng)（EPR）實現(xiàn)被動靶向[1012]。因此，本課題組用普朗尼克F127（Pluronic F127）和Dα維生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯（TPGS1000 ）為復(fù)合載體，采用薄膜水化法制備蛇葡萄素納米膠束，對其制劑學(xué)性質(zhì)及體外抗腫瘤活性進行考察，為蛇葡萄素新劑型的研究奠定基礎(chǔ)。

1材料

LC2010A高效液相色譜儀（日本島津公司）；LCsolution色譜工作站（日本島津公司）；EL2042C型電子分析天平（梅特勒勒托利多儀器有限公司）；Nicomp 380ZLS粒度及Zeta電位檢測分析儀（美國PSS公司）；Tecnai G2 20ST型透射電鏡（美國FEI 公司），RE5230旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHAA水浴恒溫振蕩器（江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠）；SB5200DT超聲波清洗機（寧波新芝科技股份有限公司）；BioRAD680 酶標儀（美國BioRAD 公司）；透析袋（8 000～14 000 Da，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司）。

蛇葡萄素對照品（純度>98%，張家界生力生物有限公司，批號130926）；Dα維生素E聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯（TPGS1000，Sigma公司，批號130610）；普朗尼克F127（Sigma公司，批號130117）；人乳腺癌細胞系（MCF7細胞，南京凱基生物技術(shù)有限公司）；胎牛血清、胰蛋白酶、1640 培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（PBS）均購自美國Hyclone 公司；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

21納米膠束的制備

分別精密稱取聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯（TPGS1000）和普朗尼克F127（5∶15）適量，按藥載比為1∶20稱取蛇葡萄素置于茄形瓶中，加入適量甲醇經(jīng)超聲波振蕩溶解，于37 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇，待茄形瓶底部及內(nèi)壁形成一層均勻的薄膜，加入純化水50 mL，37 ℃下超聲波（240 W，40 kHz）振蕩水化至薄膜溶解，依次分別用孔徑02， 01 μm的聚碳酸酯膜過濾，各重復(fù)3次，即得蛇葡萄素混合納米膠束制劑。

22HPLC測定納米膠束中蛇葡萄素含量

221色譜條件采用Wondasil C18 （46 mm×250 mm， 5 μm）色譜柱，以甲醇水磷酸 （35∶65∶02）為流動相，流速10 mL·min-1，檢測波長292 nm，柱溫25 ℃，進樣量20 μL[13]。

222含量測定按文獻[13]方法，精密量取蛇葡萄素納米膠束各01 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇超聲波（240 W，40 kHz）處理10 min，甲醇稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件測定峰面積，計算。測得質(zhì)量濃度為（327±004） g·L-1。

23包封率及載藥量的測定

按文獻[13]方法，精密量取已知含量的蛇葡萄素納米膠束溶液50 mL置于燒杯中，將裝有2 mL純化水的透析袋兩端扎緊后置于其中進行反透析，4 h后取袋內(nèi)的溶液05 mL，以甲醇稀釋定容至10 mL，按上述色譜條件進樣檢測，記錄峰面積，計算得游離蛇葡萄素濃度Cfree，按包封率=（50Ctotal-52Cfree）/50Ctotal×100%，計算包封率[13]，Ctotal為蛇葡萄素納米膠束溶液中的蛇葡萄素含量。結(jié)果表明，蛇葡萄素納米膠束的包封率為（8042±113）%。

同時將經(jīng)反透析后的膠束溶液進行冷凍干燥，稱其質(zhì)量M，按載藥量=（50Ctotal-52Cfree）/（M-Cfree）×100%計算載藥量。結(jié)果表明蛇葡萄素納米膠束的載藥量為（441±026） %。

24滲漏率的測定

將蛇葡萄素納米膠束溶液灌封于安瓿中，分別于室溫（25 ℃） 、冷藏條件（4 ℃）放置，于0，5，15，30 d 取樣，測定放置前后的游離藥物量，按滲漏率=（Mt-M0）/（M-M0）×100%計算，結(jié)果見表1。式中Mt為貯存一段時間后測得游離藥物的量，M0為貯存前游離藥物的量，M為納米膠束中藥物總量。

結(jié)果表明，在冷藏條件（4 ℃）下，蛇葡萄素納米膠束滲漏率未見明顯變化，穩(wěn)定性較好；而在室溫（25 ℃）下，滲漏率隨時間延長呈逐漸增長趨勢，提示該膠束在常溫下溶液穩(wěn)定性較差，可通過凍干處理成固體粉末以解決滲漏穩(wěn)定性問題，該部分研究將在后續(xù)進一步開展。

25制劑工藝優(yōu)化

251水化溶劑體積的篩選固定其他工藝條件，分別考察不同體積的水化溶劑對所制備蛇葡萄素納米膠束包封率的影響，結(jié)果見表2。當水化溶劑體積從10 mL增加至50 mL時，膠束的包封率呈微弱下降；當增加至80 mL時，包封率出現(xiàn)明顯的下降。綜合考慮到水化過程及包封率測定的可操作性，選擇50 mL。

252藥載比的影響選取5個不同的藥物與載體比例，分別制備蛇葡萄素納米膠束，并對其載藥量、包封率、粒徑進行考察，結(jié)果見表3。固定載體質(zhì)量為100 mg 時，當藥物質(zhì)量為5 mg時，藥物包封率最高，達到80%以上，但隨著藥物質(zhì)量的增加，包封率隨之降低，當藥物質(zhì)量為15 mg以上時，由于疏水性內(nèi)核中的藥物達到過飽和，在水化過程中即出現(xiàn)藥物析出而導(dǎo)致包封率等參數(shù)無法準確測定。此外從穩(wěn)定性方面考察，當藥物質(zhì)量為10 mg時，在4 ℃存放第5天即出白色藥物析出，而藥物為5 mg的樣品可存放30 d以上且包封率未出現(xiàn)明顯下降。綜合考慮，優(yōu)選藥載比為5∶100。

253TPGS1000與F127的比例篩選固定其他工藝參數(shù)，選取4種不同質(zhì)量比例的復(fù)合載體制備蛇葡萄素納米膠束，考察包封率及滲漏率進行評價，結(jié)果見表4。當TPGS1000的添加量為0時，納米膠束的包封率偏低（40%），隨著TPGS1000的開始加入，納米膠束的包封率出現(xiàn)明顯增大（>70%），但隨著TPGS1000加入比例繼續(xù)提高，其包封率并未出現(xiàn)相應(yīng)的增大。此外，從穩(wěn)定性角度考慮，同樣在4 ℃條件下貯存30 d，5∶15載體比例的納米膠束的滲漏率最低，故選擇該比例作為最佳載體比例。

26膠束的粒徑、電位與形態(tài)

取適量蛇葡萄素納米膠束，用純化水稀釋10倍，混勻，經(jīng)022 μm的微孔濾膜過濾。使用激光粒度儀測定膠束的粒徑和Zeta電位。每個樣品測定20個循環(huán)時間，測定溫度設(shè)定為25 ℃。實驗結(jié)果表明，蛇葡萄素納米膠束的平均粒徑為（226±05）nm，Zeta電位為（-2073±013）mV，多分散系數(shù)為023，表明分散度良好，膠束的粒徑較小且分布較窄，見圖1。

取適量蛇葡萄素納米膠束，用純化水進行稀釋，經(jīng)022 μm微孔濾膜過濾后，將鋪有碳膜的銅網(wǎng)漂放在納米膠束溶液上，1～2 min后取出銅網(wǎng)，用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸干多余液體。將俘獲有納米膠束粒子的銅網(wǎng)漂放在1%醋酸雙氧鈾染液上約1 min，取出，同樣用濾紙吸干多余液體。室溫放置過夜后，將晾干的銅網(wǎng)放入透射電鏡儀，在加速電壓160 kV下觀察納米膠束外部形態(tài)，見圖1。納米膠束均為球形，外觀圓整，粒徑均一，約20～30 nm，粒徑大小與激光粒度儀測得的結(jié)果一致。

27表觀溶解度測定

分別將過量的蛇葡萄素、蛇葡萄素納米膠束凍干粉加入一定量純化水中，于25 ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩，待平衡后分別取樣適，置于10 mL量瓶中加甲醇稀釋定容。經(jīng)022 μm微孔濾膜濾過后，按22項下方法測定，計算表觀溶解度。結(jié)果顯示，制成納米膠束后，蛇葡萄素溶解度由0486 g·L-1提高至7744 g·L-1，提高16倍左右。說明此納米膠束對蛇葡萄素有很強的增溶能力。

28體外釋放研究

分別取已知含量的膠束溶液劑及蛇葡萄素原料藥混懸液2 mL放入到預(yù)先處理好的透析袋中，并將透析袋置于100 mL釋放介質(zhì)中，即pH 65 磷酸鹽緩沖液（PBS）及pH 74 PBS，于（370±05）℃恒溫水浴振蕩（100 r·min-1），分別定時取樣1 mL，并補充同溫等量釋放介質(zhì)。樣品用022 μm 微孔濾膜濾過，按22項下方法測定，計算累計釋放率，繪制釋藥曲線，結(jié)果見圖2，3。由于蛇葡萄素的水溶性差，在12 h內(nèi)僅釋放30%左右。蛇葡萄素納米膠束在模擬血液（pH 74）和腫瘤細胞外液（pH 65）的環(huán)境下，釋放行為基本一致，在前2 h僅累積釋放藥物10%左右，隨后釋放加速，8 h釋放達90%左右，12 h釋放達100%。

29細胞毒性實驗

采用MTT法，取對數(shù)生長期的MCF7 細胞用胰酶消化，接種于96孔板， 調(diào)整細胞濃度使每孔104個，置培養(yǎng)箱中孵育24 h使其貼壁。次日加入適當濃度的蛇葡萄素，每組設(shè)3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，吸棄各孔液體，加入5 g·L-1 MTT溶液20 μL，置培養(yǎng)箱中（37 ℃，5% CO2）孵育4 h，吸棄各孔液體，加入150 μL 的DMSO，混勻后使用酶標儀在492 nm 處測定各孔調(diào)零后的吸光度。計算細胞增殖抑制率=（1-A實驗/A對照）×100%，結(jié)果見表5。

結(jié)果表明，蛇葡萄素納米膠束對乳腺癌細胞MCF7的抑制率明顯高于蛇葡萄素原料組，兩者具有顯著差異（P<00l）。通過GraphPad prism 50 軟件擬合數(shù)據(jù)計算蛇葡萄素與蛇葡萄素納米膠束對MCF7 細胞的IC50分別為2328，776 mg·L-1，可知，經(jīng)過72 h干預(yù)，混合納米膠束的IC50明顯低于蛇葡萄素原料藥的IC50，綜上表明蛇葡萄素包裹于混合納米膠束中能顯著提高其對乳腺癌細胞MCF7的抑制率。

3討論

普郎尼克F127在水溶液中能自發(fā)聚集形成膠束使難溶性藥物被包裹在其中，從而提高藥物的溶解度，增加穩(wěn)定性，延長藥物體內(nèi)循環(huán)時間。但普郎尼克F127的臨界膠束濃度比較大，當用溶液稀釋時很容易導(dǎo)致膠束不穩(wěn)定。加入TPGS1000構(gòu)成混合體系能降低膠束的臨界膠束濃度，同時其結(jié)構(gòu)中含有芳香環(huán)，可使膠束疏水核體積增大，從而使更多的難溶藥物進入膠束的疏水核，提高膠束的包封率和載藥量[14]?；诖耍菊n題組選擇普郎尼克F127和TPGS1000共同構(gòu)建蛇葡萄素混合膠束體系，并得到很好的驗證。

制備膠束的水化條件包括水化溶劑種類、體積、水化時間、水化溫度等，這些均可能不同程度地影響膠束的包封率與粒徑等重要質(zhì)量指標。實驗中發(fā)現(xiàn)某些常用試劑（如 Hepes緩沖液）對膠束的形成及含量測定均產(chǎn)生不利影響，為減少干擾，采用純化水為水化溶劑。經(jīng)初步比較，水化時間及溫度對本處方工藝制備的膠束影響不大，同時考慮到對藥物穩(wěn)定性影響，故在37 ℃下水化溶解后即直接用02，01 μm的聚碳酸酯膜對膠束進行擠壓過濾。水化溶劑體積越大，溶解藥物越多，導(dǎo)致膠束包封率下降明顯。

細胞毒性結(jié)果表明，對于MCF7細胞，載藥膠束的細胞毒性遠遠高于原料藥。這是由于蛇葡萄素包入膠束后溶解度增大，亦更容易進入細胞內(nèi)所造成的。在高濃度時，空白膠束與原料藥相比，也顯示出一定的細胞毒性。這與文獻報道的TPGS在較高濃度對特定細胞具有一定的細胞毒性相一致。關(guān)于該膠束在動物體內(nèi)的藥物動力學(xué)過程與藥效將在后續(xù)研究中進一步開展。

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[責任編輯孔晶晶]