李軍　楊卓　紀(jì)宏偉　門明新

摘要：以Cr污染土壤為菌源樣品，富集培養(yǎng)與菌株分離后，采用二苯碳酰二肼分光光度法從中篩選Cr吸附菌株，共篩選分離出4株高效吸附重金屬Cr的細(xì)菌菌株。通過形態(tài)觀察、生理生化試驗對4株菌株進(jìn)行了種屬鑒定，初步鑒定4株菌株均為芽孢桿菌（Bacillus）。

關(guān)鍵詞：土壤污染；重金屬Cr；吸附；菌株篩選；種屬鑒定

中圖分類號：X53 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）09-2218-04

隨著社會經(jīng)濟(jì)和工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，中國甚至全球許多國家面臨嚴(yán)重的Cr污染威脅，土壤Cr污染已成為人們普遍關(guān)注的環(huán)境污染問題之一。Cr鹽、皮革、印染、電鍍等涉Cr工業(yè)的發(fā)展以及城市污水的非達(dá)標(biāo)排放對農(nóng)業(yè)土壤已造成一定的毒害，其危害由于生物放大作用也逐漸威脅人類健康。因此，Cr被列為中國農(nóng)田土壤環(huán)境質(zhì)量評價的8個重金屬控制指標(biāo)之一。

土壤中的Cr最初來源于巖石風(fēng)化，在自然條件作用下轉(zhuǎn)移到成土母質(zhì)及土壤中：其次，隨著城市化的推進(jìn)。城市污水灌溉、污泥及城市垃圾正在成為土壤Cr的另一個主要來源；另外，隨著冶金、制革、電鍍等涉及Cr污染工業(yè)的發(fā)展，某些工廠和Cr污染源所產(chǎn)生的含Cr粉塵、Cr渣及被Cr污染的地下水也能通過各種途徑進(jìn)入土壤造成Cr的累積。通常，低濃度的Cr對多種農(nóng)作物的生長有刺激作用，但是高濃度的Cr則會危害農(nóng)作物。另一方面人類食用Cr含量超標(biāo)的糧食、蔬菜后，進(jìn)入人體，很可能會誘發(fā)多種慢性疾病的發(fā)作。

Cr污染土壤的治理途徑主要有兩種：一是改變Cr在土壤中的存在形態(tài)，將Cr⁶⁺還原成Cr³⁺，降低其在環(huán)境中的遷移能力和生物可利用性：二是將Cr從被污染土壤中清除。根據(jù)以上兩種思路發(fā)展出生物修復(fù)、工程修復(fù)、加入改良劑及農(nóng)業(yè)措施等治理方法，但是生物修復(fù)技術(shù)中利用微生物處理污染土壤中重金屬Cr是目前實踐證明最有發(fā)展前途的一種新的重金屬污染處理方法，與傳統(tǒng)的處理方法相比，其具有無二次污染、處理效率高、適應(yīng)范圍廣、成本低等優(yōu)點，在治理土壤重金屬污染中有著很大的應(yīng)用前景，具有很高的研究價值。本研究目的是從污染土壤中篩選、分離高效吸附重金屬Cr的細(xì)菌菌株。并且對吸附能力較高的菌株進(jìn)行種屬鑒定，以期為生物技術(shù)治理土壤Cr污染提供菌種資源，并為其進(jìn)一步研究奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌源樣品

污染土樣：采用五點法，取污水處理廠周邊（表1）的土壤樣品混合。鏟去表面土層。取5-10cm深處的土壤，裝入無菌袋，記錄取樣地點、時間等，帶回實驗室，4℃冰箱保藏備用。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 菌株分離篩選培養(yǎng)基 ①基礎(chǔ)培養(yǎng)基。NA培養(yǎng)基：用于菌株的分離及保存；NB培養(yǎng)基：用于菌株液體培養(yǎng)及種子制備。⑦富集培養(yǎng)基。含100、300、500mg/LCr⁶⁺的液體培養(yǎng)基，用于重金屬Cr吸附菌株的富集培養(yǎng)。③初篩培養(yǎng)基——分離培養(yǎng)基。NA培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加終濃度為500mg/L的Cr⁶⁺，用于菌株分離、馴化。

1.2.2 復(fù)篩培養(yǎng)基

NB培養(yǎng)基，用于菌株培養(yǎng)獲得菌泥，以測定菌株對Cr的吸附能力。

1.2.3 菌種鑒定培養(yǎng)基

根據(jù)常見細(xì)菌系統(tǒng)學(xué)鑒定手冊配制。

1.3 試驗方法

1.3.1 Cr吸附菌株的分離篩選——菌株的富集、分離及純培養(yǎng) 取5.0g土樣于含100mg/LCr⁶⁺的液體富集培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)3d，轉(zhuǎn)接3次，富集培養(yǎng)液的Cr⁶⁺濃度以200mg/L遞增，直到Cr⁶⁺濃度達(dá)到500mg/L。將馴化后的菌株培養(yǎng)液涂布于含500mg/L Cr⁶⁺的NA培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)。將菌落生長特征不同的菌株挑取到NA斜面上培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)至菌苔長滿，置于4℃冰箱備用，用于進(jìn)一步地篩選、鑒定。

1.3.2 Cr⁶⁺標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 向一系列50mL比色管中分別加入0、0.20、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00和10.0mL Cr⁶⁺標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水稀釋至標(biāo)線。向比色管中加入2mL顯色劑。搖勻，放置10min，在540nm波長下，以去離子水作為參照。測量吸光度。繪制Cr⁶⁺含量對吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 菌株復(fù)篩——菌株吸附Cr⁶⁺能力測定 制備初篩菌株的菌泥備用。三角瓶中裝入濃度為1000μg/L的Cr⁶⁺標(biāo)準(zhǔn)液，接入菌泥，充分振蕩搖勻后搖床培養(yǎng)，以不接菌泥作為對照。每1h取樣1次，以5000r/min離心10min，采用二苯碳酰二肼顯色一紫外分光光度法測定上清液中Cr⁶⁺的濃度，以此確定各菌種對Cr⁶⁺的吸附情況。每個樣品3次重復(fù)。按以下公式計算菌體對Cr⁶⁺的吸附率（Q）：Q：[（C₀-C_t）/C₀]×100%。式中，C為重金屬離子初始濃度（mg/L），C_t為重金屬離子平衡濃度（mg/L），挑選出吸附效果最好的菌種，用于菌株種屬鑒定。

1.4 菌株種屬鑒定

首先進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，將所得菌株劃線接種于固體平板上，37℃培養(yǎng)24h，觀察單菌落形態(tài)。然后進(jìn)行革蘭氏染色試驗，最后進(jìn)行生理生化試驗，根據(jù)常見細(xì)菌系統(tǒng)學(xué)鑒定手冊進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cr吸附菌株的富集與分離

通過對菌液進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，隨著Cr⁶⁺濃度的增加，菌落的數(shù)量明顯減少。Cr⁶⁺濃度為500mg/L時，選擇合適稀釋濃度涂布的培養(yǎng)基平板，對生長較好的細(xì)菌進(jìn)行分離純化，得到18株形態(tài)各異的Cr吸附細(xì)菌，編號為A-1、A-2、B-1、B-2、C-1、CX-9-1、CX-9-2、D-1、E-1、E-2、F-1、G-1、H-1、I-1、K-1、M-1、N-1、O-1，將所篩選的菌株接種到NA斜面培養(yǎng)基上備用。

通過對18株菌株的菌落形態(tài)觀察，初步判斷為細(xì)菌菌落，圓形或近圓形、濕潤不透明，詳細(xì)描述見表2。

2.9 菌株吸附Cr⁶⁺能力測定

Cr⁶⁺濃度（x）與吸光度（y）的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，各菌株對Cr的吸附情況見表3。由表3可以看出，菌株對重金屬Cr的吸附作用存在差異，按2h時的吸附能力排序為H-1=M-1>CX-9-1>CX-9-2>E-1=G-1>F-1>N-1>0-1>A-1>I-1>B-1>K-1>B-2>D-I>A-2>E-2>C-1，其中對重金屬Cr吸附效果排前4位的4株菌株在處理2h時的吸附率分別達(dá)98.86%、98.86%、97.02%、96.73%，說明這4株菌株具有較好的應(yīng)用前景。

2.3 4株菌株的種屬鑒定

2.3.1 菌落特征 CX-9-1菌落直徑為1.0cm，呈圓形，白色，邊緣不整齊，容易挑取，中間有隆起，菌落不透明，有褶皺，表面干燥：CX-9-2菌落直徑為0.9cm，呈圓形，白色，邊緣整齊，不容易挑取，中間有隆起，菌落不透明，無褶皺，表面干燥；H-1菌落直徑為0.3cm，呈圓形，微黃色，邊緣不整齊，容易挑取，扁平，菌落不透明，無褶皺，表面濕潤：M-1菌落直徑為0.2cm，呈不規(guī)則圓形，微黃色，邊緣整齊，不容易挑取，中間有隆起，菌落不透明，無褶皺，表面濕潤（表2）。根據(jù)以上形態(tài)特征初步判斷4株菌株均為細(xì)菌菌落，菌落形態(tài)見圖2。

2.3.2 菌體形態(tài)特征 供試菌株經(jīng)革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察，都為桿菌，CX-9-1、M-1革蘭氏染色呈陽性（圖3）。

2.3.3 生理生化試驗結(jié)果 生理生化試驗包括V.P試驗、硝酸鹽還原試驗、淀粉水解試驗、接觸酶試驗、葡萄糖氧化發(fā)酵試驗、檸檬酸鹽試驗等18項，試驗結(jié)果如表4所示，根據(jù)試驗結(jié)果與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》作初步判斷，判定CX-9-1、CX-9-2、H-1、M-1四株菌株均為芽孢桿菌（Bacillus）。結(jié)果為土壤Cr污染的微生物治理提供了菌種資源，并為其進(jìn)一步深入研究奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。

微生物吸附法去除土壤中Cr⁶⁺的研究較少。Srivastava等研究表明，土壤中Cr⁶⁺含量為250mg/kg、黑曲霉作為吸附劑時，15d內(nèi)Cr⁶⁺的去除率為75%。萬俊杰等利用微生物代謝產(chǎn)生的γ-聚谷氨酸絮凝劑對含Cr⁶⁺廢水進(jìn)行Cr⁶⁺去除處理，結(jié)果顯示，pH為4，30mL30mg/L的廢水中添加γ-聚谷氨酸1.5mL和1%CaCl₂2.4mL時，Cr⁶⁺的去除率可達(dá)55%。盛姣等通過試驗得出微生物發(fā)酵米糠對Cr⁶⁺的最佳吸附條件為微生物發(fā)酵米糠濃度10g/L、溫度60℃、pH2、Cr⁶⁺質(zhì)量濃度不超過40mg/L、吸附平衡時間40min時，吸附率達(dá)95.7%。Valerie等將含Cr泥土與鏈霉菌在培養(yǎng)基中混合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)泥土中Cr⁶⁺濃度為1800mg/kg時，經(jīng)過30d后，去除率達(dá)到100%。本研究中篩選出的4株菌株較上述各研究中對Cr的吸附率更高，應(yīng)用前景更廣，可以將這些菌株進(jìn)行進(jìn)一步試驗研究，探討溫度、pH、初始Cr濃度等因素對其吸附Cr的影響。

關(guān)于土壤Cr污染的生物技術(shù)治理，國內(nèi)外學(xué)者們已經(jīng)進(jìn)行了大量相關(guān)研究，篩選出一些重金屬Cr吸附菌株，如硫酸鹽還原菌、芽孢桿菌屬、埃希氏菌屬、陰溝桿菌、大腸桿菌、假單胞菌屬等。胡勇等從不同來源的樣品中分離出吸附Cr⁶⁺較強(qiáng)的菌株X07，經(jīng)鑒定為蠟狀芽孢桿菌（B.CereUS）：周鳴等從污染土壤中分離出地衣芽孢桿菌（B.licheni-formais），利用其死菌體進(jìn)行Cr6+吸附動力學(xué)研究；魏斐等篩選出的去除Cr⁶⁺的菌株經(jīng)鑒定為蘇云金芽孢桿菌（B.mucilaeinosus），本試驗中篩選出的菌種均為芽孢桿菌，與前人的研究結(jié)果相一致。由此可見，芽孢桿菌屬細(xì)菌在土壤重金屬Cr污染的治理中具有十分廣闊的應(yīng)用前景。