項(xiàng)東全 王小勇

摘要：目的 通過電鏡技術(shù)研究二磷酸鹽對體外人骨巨細(xì)胞瘤（GCT）單核基質(zhì)細(xì)胞（Stc）影響后細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化，為GCT新的輔助治療方案的確立提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 用膠原酶-Ⅱ消化法體外分離培養(yǎng)8例新鮮GCT標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng)獲得原代Stc并進(jìn)行傳代；電鏡觀察實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞核超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果 二磷酸鹽作用48 h（100 μmol/L）后電鏡觀察到細(xì)胞胞質(zhì)濃縮、核凝聚、核碎裂和凋亡小體形成。結(jié)論 在一定濃度范圍內(nèi)，二磷酸鹽可抑制人GCT單核基質(zhì)細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，電鏡技術(shù)在研究二磷酸鹽對人GCT中Stc體外誘導(dǎo)凋亡研究中具有重要價(jià)值。

關(guān)鍵詞：電鏡；二磷酸鹽；骨巨細(xì)胞瘤；單核基質(zhì)細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；凋亡

骨巨細(xì)胞瘤（GCT）是一種常見的具有潛在惡性的骨腫瘤，約占骨腫瘤發(fā)病的14%～16%[1]，多發(fā)生于干骺端，具有局部侵襲性破壞骨質(zhì)、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的潛在惡性特征。目前多數(shù)GCT的治療是病灶刮除加植骨，但其復(fù)發(fā)率很高。本實(shí)驗(yàn)通過電鏡技術(shù)觀察二膦酸鹽對人Stc增殖和凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 標(biāo)本來源8例長骨骨巨細(xì)胞瘤手術(shù)標(biāo)本由山西醫(yī)科大學(xué)附屬二院骨病科提供。所有標(biāo)本均經(jīng)病理切片診斷核實(shí)。

1.2方法

1.2.1骨巨細(xì)胞瘤單核基質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)及純化，在無菌條件下取骨巨細(xì)胞瘤質(zhì)脆軟的部分（0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm），用含青霉素（1 g/l）和鏈霉素（1 g/l）的無菌PBS液中浸泡3遍，至顏色淡白，在含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中用眼科小剪刀輕輕剪碎，加入現(xiàn)配好的膠原酶Ⅱ（10 mg/ml）1 ml，吹吸數(shù)十次后，放入37℃水浴箱中，孵育50 min，然后使用200目濾網(wǎng)過濾，加入6～8 ml含15%胎牛血清DMEM，4℃ 1000 r/min離心10 min，棄去上清液，加入3～4 ml含15%胎牛血清的DMEM，吹打均勻，將細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)瓶放入37℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中8 h，棄去未貼壁細(xì)胞懸液，無菌PBS清洗2次，胰酶消化1～2 min，加入含15%胎牛血清的DMEM，吹打均勻后放入孵箱，重復(fù)2～3次可以達(dá)到純化。

1.2.2倒置顯微鏡觀察 培養(yǎng)過程中，定期用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀況：分離培養(yǎng)的瘤細(xì)胞，在純化以前可見大量未貼壁的血細(xì)胞，和少部分貼壁的多核巨細(xì)胞，胰酶消化2～3次后，多核巨細(xì)胞變少甚至消失。純化的單核基質(zhì)細(xì)胞呈上皮形，梭形或多角形，排列成束狀或漩渦狀，4～5 d長滿傳代，2～3 d換液。其中2例作長期培養(yǎng)，可以傳25～30代，為期100 d。

1.2.3二膦酸鹽對體外GCT單核基質(zhì)細(xì)胞的影響

1.2.3.1普通光學(xué)顯微鏡動態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)變化。

1.2.3.2透射電鏡觀察凋亡細(xì)胞經(jīng)濃度為100 μmol/L二膦酸鹽作用48 h后，用刮刀將其從瓶底刮下，3%戊二醛固定，再用1%鋨酸固定，逐級酒精脫水，氧化丙烯浸透，樹脂包埋，超薄切片機(jī)切片，透射電子顯微鏡下觀察并攝影。

2 結(jié)果

二膦酸鹽對體外GCT單核基質(zhì)細(xì)胞的影響。

2.1普通光學(xué)顯微鏡觀察 實(shí)驗(yàn)組Stc經(jīng)一定濃度二膦酸鹽（100 μmol/L）作用一定時(shí)間（48 h）后，細(xì)胞生長速度減慢，貼壁能力下降，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生皺縮、偽足變少、細(xì)胞變圓，失去原有的多邊形特點(diǎn)，體積變小，胞質(zhì)密度增高，細(xì)胞核膜保持完整，染色質(zhì)進(jìn)行性固縮等變化。

2.2透射電鏡觀察 凋亡Stc經(jīng)濃度為100 μmol/L二膦酸鹽作用48 h后，細(xì)胞體積縮小，胞膜完整但發(fā)生皺縮，染色質(zhì)凝聚、固縮、邊聚，部分出現(xiàn)核碎裂，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)基本完好，胞質(zhì)出芽，凋亡小體形成，見圖1。

3 討論

3.1電鏡在凋亡檢測方法的綜合選取中的優(yōu)勢 細(xì)胞發(fā)生凋亡是一種主動的死亡過程，呈現(xiàn)特有的有別于細(xì)胞壞死的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)變化特點(diǎn)。

形態(tài)學(xué)是鑒定細(xì)胞凋亡最可靠的方法。凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化有：凋亡早期的胞膜完整性未破壞，表現(xiàn)為膜發(fā)泡，芽生形成膜包裹的凋亡小體，內(nèi)含完整的細(xì)胞器和核碎片。細(xì)胞變圓，失去原有的多邊形特點(diǎn)，體積變小，胞質(zhì)密度增高。細(xì)胞核膜保持完整，染色質(zhì)進(jìn)行性固縮，并向核周形成塊狀結(jié)構(gòu)、致密小體，或邊集于核膜內(nèi)側(cè)呈新月體形。壞死則多表現(xiàn)為細(xì)胞的腫脹變圓，早期胞膜破損，形成大小不一的碎片，而核的變化發(fā)生較晚。形態(tài)學(xué)上早期細(xì)胞凋亡明顯不同于細(xì)胞壞死，但最終凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞一樣發(fā)生細(xì)胞膜的損傷。因此凋亡早期，細(xì)胞膜完整性及核固縮現(xiàn)象是判斷細(xì)胞凋亡還是壞死的重要手段，常用的方法有丫啶橙-溴化乙啶雙染及Giemsa染色等方法，而使用高倍率的電鏡則可直接觀察到細(xì)胞核固縮的變化。

3.2二膦酸鹽誘導(dǎo)Stc凋亡效應(yīng) 二膦酸鹽的抗骨吸收的作用機(jī)制[2]可能為以下三點(diǎn)：①直接改變破骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)，使成熟破骨細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)和形態(tài)發(fā)生變化，從而誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡；②與骨基質(zhì)理化結(jié)合，抑制溶酶體酶以及前列腺素等的合成，導(dǎo)致破骨細(xì)胞功能下降；③直接抑制成骨細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞因子如IL-6、TNF的產(chǎn)生[3]，促使成骨細(xì)胞釋放出可溶性因子，作用于破骨細(xì)胞的前體，防止破骨細(xì)胞的形成，為骨巨細(xì)胞瘤術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的防治探索一條新的途徑。該研究表明二磷酸鹽很可能是一種潛在的有前途的治療GCT的方法。

本實(shí)驗(yàn)研究中觀察在一定濃度二磷酸鹽（即100 μmol/L）下經(jīng)過48 h誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的GCT細(xì)胞凋亡，透射電鏡觀察凋亡小體及凋亡細(xì)胞細(xì)胞器超微變化：Stc經(jīng)濃度為100 μmol/L二磷酸鹽作用48 h后，細(xì)胞體積縮小，胞膜完整但發(fā)生皺縮，染色質(zhì)凝聚、固縮、邊聚，部分出現(xiàn)核碎裂，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)基本完好，胞質(zhì)出芽，可見凋亡小體形成，該方法從直觀形態(tài)學(xué)角度提示Stc在體外經(jīng)過一定濃度一定時(shí)間的二磷酸鹽作用后可以發(fā)生細(xì)胞凋亡。

總之，凋亡檢測方法很多，實(shí)驗(yàn)過程中很少全部應(yīng)用，而電鏡在凋亡檢測方法的綜合選取中的優(yōu)勢在于能為細(xì)胞凋亡研究提供更加直接豐富的圖像信息，可清晰顯示細(xì)胞膜完整性、核固縮現(xiàn)象、凋亡小體形成等，對觀察凋亡細(xì)胞的細(xì)胞器水平變化有重要意義，因此通過電鏡手段觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化很有必要。

參考文獻(xiàn)：

[1]Cowan RW，Singh G.Giant cell tumor of bone：a basic science perspective[J].Bone，2013，52（1）：238-246.

[2]Chen G，Deng C，Li YP.TGF-beta and BMP signaling in osteoblast differentiation andbone formation[J].Int J Biol Sci，2012，8（2）：272-288.

[3]Bose S，Roy M，Bandyopadhyay A.Recent advances in bone tissue engineering scaffolds[J].Trends Biotechnol，2012，30（10）：546-554.

編輯/翟辰萬