孫文靜 王洪剛 李興鋒

摘要：濱麥草[Leymus mollis（Trin.）Hara]具有抗病耐逆等多種優(yōu)良特性，是進行普通小麥遺傳改良的重要基因資源之一。本研究選用757對EST-SSR、STS引物，對濱麥草、華山新麥草（Psathyrostachys huashanica）以及普通小麥品種中國春、輝縣紅、煙農(nóng)15、濟麥22進行擴增，從中篩選和鑒定濱麥草特異分子標記，推斷其染色體基組歸屬。結(jié)果共篩選獲得193個濱麥草特異分子標記，其中包括36個濱麥草Ns基組的特異標記。該研究結(jié)果對于促進濱麥草優(yōu)異基因向小麥的轉(zhuǎn)移、培育小濱麥新種質(zhì)具有一定的實踐價值和意義。

關鍵詞：濱麥草；普通小麥；特異分子標記

中圖分類號：S512.9文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）08-0005-05

AbstractLeymus mollis （Trin.） Hara （2n=28， NsNsXmXm） is one of the important genetic resources for wheat genetic improvement， which possesses a variety of excellent antiviral properties such as disease resistance and adversity tolerance. In this study， 757 pairs of EST-SSR and STS primers were used to amplify the genomic DNA of L. mollis， Psathyrostachys huashanica and wheat varieties China Spring， Huixianhong， Yannong 15 and Jimai 22. And the specific molecular makers were screened for L. mollis， and were used to infer the chromosome-based group home. The results showed that 193 specific markers of L. mollis were screened out including 36 specific markers belonging to Ns group. The results have some practical values and significances to promoting the excellent gene of L. mollis transfer into wheat and breeding new Tritileymus germplasms.

KeywordsLeymus mollis； Common wheat； Specific molecular markers

小麥是世界重要糧食作物之一，是我國北方地區(qū)的主要糧食作物。目前，生產(chǎn)上推廣使用的小麥品種遺傳基礎單一，能被育種利用的品種資源日益匱乏，嚴重制約小麥育種工作進展。拓寬小麥的遺傳基礎，豐富小麥的遺傳多樣性是當前小麥育種和遺傳改良的重要內(nèi)容之一。小麥的近緣物種類型繁多，變異多樣，含有一系列在小麥育種中具有重要利用價值的抗病、耐逆優(yōu)良基因[1，2]。利用多種手段將小麥近緣物種中蘊藏的多種有益基因轉(zhuǎn)移進栽培小麥，豐富小麥育種的遺傳基礎，是進行小麥遺傳改良的有效途徑和重要方向。

濱麥草[Leymus mollis（Trin.）Hara，NsNsXmXm，2n=4x=28]主要生長在沿海和內(nèi)陸干旱地區(qū)，具有抗條銹病、白粉病、赤霉病、蚜蟲和抗旱、耐鹽堿、大穗多花等優(yōu)良特性，是小麥重要的近緣植物之一[3-10]。早在20世紀50年代，前蘇聯(lián)的齊津等就通過胚培養(yǎng)獲得了四倍體、六倍體小麥與濱麥草的雜種[11]；60年代獲得了雜種的雙二倍體[2]；70年代獲得了硬粒小麥與濱麥草的不完全雙二倍體[2]；傅杰等通過八倍體小濱麥與普通小麥和缺體雜交、回交，創(chuàng)制了一些農(nóng)藝性狀優(yōu)良的濱麥草異源種質(zhì)系，經(jīng)鑒定仍帶有濱麥草的一些特性，尤其對條銹病具有良好的抗性[12]。 以往研究將濱麥草染色體組成表示為JJNN，之后又將濱麥草染色體組成表示為NsNsXmXm。本實驗室通過雜交、回交等技術(shù)也創(chuàng)制了一些農(nóng)藝性狀優(yōu)良的濱麥草異源種質(zhì)系，可作為向小麥中轉(zhuǎn)移濱麥草優(yōu)良基因的橋梁材料。

本研究通過對濱麥草、華山新麥草及普通小麥的全基因組掃描，篩選得到特異分子標記，可用來檢測小麥背景中的濱麥草染色體片段，也可用于基因定位、濱麥草染色體追蹤、基因的轉(zhuǎn)移和種質(zhì)系的鑒定等，進而提高小麥遺傳背景下濱麥草基因組成分的檢測效率，為濱麥草優(yōu)良性狀/基因的進一步開發(fā)利用奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料與試劑

本試驗所用材料為濱麥草（L. mollis）、華山新麥草（Psathyrostachys huashanica）、八倍體小濱麥950059、八倍體小濱麥20000302、煙農(nóng)15、濟麥22、中國春、輝縣紅。其中濱麥草引自西北農(nóng)林科技大學，華山新麥草引自四川農(nóng)業(yè)大學，均種植于山東農(nóng)業(yè)大學校內(nèi)網(wǎng)室。八倍體小濱麥950059、20000302均由國家小麥改良中心山東（泰安）分中心創(chuàng)制，其余材料均由該分中心保存。

1.2試驗方法

1.2.1基因組DNA提取按Sharp等[13]的方法進行，稍有改動。

1.2.2PCR 擴增及引物篩選選用本實驗室的757對EST-SSR、STS引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成，參照Luan等[14]描述的PCR 體系和程序，用 ABI 公司 9700 型 PCR 儀進行擴增反應。PCR 擴增體系為20 μL，含10×PCR buffer 2 μL，dNTP 0.2 mmol/L，引物0.25 μmol/L，模板 DNA 60 ng，Taq DNA 聚合酶1 U （鼎國生物技術(shù)公司）。反應程序為 94℃預變性5 min；94℃ 1 min，55～60℃ 1 min，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染顯帶。篩選出在輝縣紅、煙農(nóng)15、中國春、濟麥22中不能擴增出特異條帶而在濱麥草中能擴增出特異條帶的引物。

1.2.3原位雜交（1）染色體制片。按照普通細胞學壓片處理根尖的步驟，充分水洗后用2%纖維素酶和果膠酶（Yakult公司）37℃下酶解1 h，70%酒精沖洗2次，以45%醋酸為浸潤液在相差顯微鏡下鏡檢（或?qū)⒖ㄖZ液固定1～3 d的根尖不經(jīng)酶解，直接用45%醋酸壓片），選擇處于減數(shù)分裂中期細胞較多、并且染色體分散比較好的制片，用酒精燈來回考3～5次后壓片，液氮冷凍揭片，氣干備用。

（2）探針標記。將純化的供試材料總基因組DNA，用DIG-Nick Translation Mix 試劑盒（Roche公司）通過缺刻平移法進行標記。反應體系（20 μL）包含模板DNA 2 μg，2 mmol/L dNTP 2 μL，DNApolⅠ 5 μL，DNaseⅠ （100 mU/μL） 0.5 μL，488-5-dUTP 1 μL， ddH2O 補齊至20 μL。

將配制好的體系混勻，稍離心，15℃水浴標記1.5 h后，加入0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）1 μL，65℃處理10 min終止反應，稍離心后，將標記的探針-20℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

（3）雜交。每張玻片加入RNA酶（100 μg/mL）100 μL，蓋上塑料蓋片，37℃處理1 h，然后用2×SSC在室溫下漂洗5 min，重復2次，分別用70%、100%乙醇脫水3 min，晾干。

雜交液配制（40 μL體系）：100%甲酰胺20 μL，50%DS 8 μL，20×SSC 4 μL，10% SDS 1 μL，ssDNA 1 μL，探針DNA 100 ng，封阻DNA 8 000 ng。

雜交液90℃變性5 min，置于碎冰中6 min后加到載玻片上，蓋上塑料蓋片，置于原位PCR儀中雜交過夜。

（4）信號檢測。按照以下步驟洗片：室溫2×SSC浸泡3 min；37℃ 10%甲酰胺溶液浸泡3 min；37℃ 0.1×SSC溶液浸泡3 min，重復2次；37℃ 2×SSC溶液浸泡5 min；室溫4×SSC溶液浸泡5 min。

洗片后，每張載片加5%BSA溶液100 μL，蓋塑料膜后37℃溫育15 min；然后甩干BSA，避光條件下每片加DAPI 10 μL，蓋片，最后在OLYMPUS BX-61型熒光顯微鏡下觀察，CCD機（DS-Ri1，Nikon）采集圖像。

2結(jié)果與分析

2.1濱麥草特異標記的開發(fā)

利用本實驗室的757對EST-SSR、STS引物對濱麥草、華山新麥草、輝縣紅、煙農(nóng)15、中國春、濟麥22全基因組進行掃描，篩選得到215對濱麥草的特異引物。其中有39對引物（圖1 CWM115）在濱麥草、華山新麥草中都能擴增出特異條帶，有176對引物（圖1 SWES1147）僅在濱麥草中擴增出特異條帶。

2.2特異標記的驗證

以熒光標記的濱麥草基因組DNA為探針，對八倍體小濱麥950059、20000302進行基因組原位雜交，結(jié)果表明，八倍體小濱麥950059、20000302均含有14條外源濱麥草染色體（圖2）。

利用篩選出的215對特異引物對八倍體小濱麥950059、20000302、濱麥草、華山新麥草、煙農(nóng)15、中國春進行全基因組掃描，驗證篩得的特異標記的有效性。最終統(tǒng)計得到193個有效特異標記（表1），其中包括36個濱麥草Ns基組的特異分子標記（表2）。這193個特異標記分為四種類型：（1）僅在濱麥草中擴增出特異條帶（圖3中Xmag3459）；（2）僅在濱麥草、華山新麥草中擴增出特異條帶（圖3中Xmag557）；（3）在八倍體小濱麥950059、20000302、濱麥草、華山新麥草中都能擴增出特異條帶（圖4中CWM107）；（4）在八倍體小濱麥950059、20000302、濱麥草中擴增特異條帶（圖4中SWES969）。

3討論與結(jié)論

隨著分子生物學的發(fā)展，目前用于鑒定小麥背景中外源染色體片段/遺傳物質(zhì)的分子標記越來越多。STS標記來自基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)，分布于整個基因組中，通常其序列保守性程度較高[15，16]，可以保證有擴增產(chǎn)物。選用本實驗室757對EST-SSR、STS引物在濱麥草、華山新麥草、濟麥22、中國春、輝縣紅、煙農(nóng)15中進行濱麥草的特異性引物的初次篩選，獲得215個濱麥草特異分子標記。華山新麥草是濱麥草Ns染色體基組的供體，如引物CWM115對濱麥草、華山新麥草都擴增出特異條帶，可以確定這一類特異標記歸屬于濱麥草Ns基組，共39個。

以濱麥草基因組DNA為探針對八倍體小濱麥950059、20000302進行基因組原位雜交，確定八倍體小濱麥950059、20000302含有濱麥草染色體，可用于檢測篩選得到的濱麥草特異標記的有效性。利用獲得的濱麥草特異性引物進一步在八倍體小濱麥950059、20000302和濱麥草、華山新麥草、煙農(nóng)15、中國春中進行全基因組掃描，最終統(tǒng)計得到193個有效濱麥草特異分子標記，其中包括36個濱麥草Ns基組的特異標記。這一驗證結(jié)果說明初步篩選有效性高、可重復性強。

篩選得到的濱麥草特異分子標記可用來檢測小麥背景中的濱麥草染色體片段，也可用于基因定位、濱麥草染色體追蹤、基因的轉(zhuǎn)移和種質(zhì)系的鑒定等。

參考文獻：

[1]齊津 H B.多年生小麥[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社， 1982.

[2]李振聲.小麥遠緣雜交[M]. 北京：科學出版社， 1985.

[3]Fan X， Sha L N， Yang R W， et al. Phylogeny and evolutionary history of Leymus （Triticeae； Poaceae） based on a single-copy nuclear gene encoding plastid acetyl-CoA carboxylase [J]. BMC Evol. Biol.， 2009， 9： 247.

[4]Yang X F， Wang C Y， Li X， et al. Development and molecular cytogenetic 352 identification of a novel wheat-Leymus mollis Lm#7Ns （7D） disomic substitution line with stripe rust resistance [J]. PLoS ONE， 2015， 10（10）：e0140227.

[5]Yang X F， Wang C Y， Chen C H， et al. Chromosome constitution and origin analysis in three derivatives of Triticum aestivum-Leymus mollis by molecular cytogenetic identification [J]. Genome， 2014， 57（11/12）： 583-591.

[6]Faith A M B. Analysis of the breeding potential of wheat-Agropyron and wheat-Elymus derivatives. I. Agronomic and quality characteristics [J]. Hereditas， 1983， 98： 287-295.

[7]何方. 小麥-濱麥草中間材料的創(chuàng)制及鑒定 [D]. 泰安： 山東農(nóng)業(yè)大學，2008.

[8]Habora M E E， Eltayeb A E， Oka M， et al. Cloning of allene oxide cyclase gene from Leymus mollis and analysis of its expression in wheat-Leymus chromosome addition lines [J].Breeding Science， 2013， 63： 68-76.

[9]Mujeeb-Kazi A，Bernard M， Bekele G T， et al. Incorporation of alien genetic information from Elymus giganteus into Triticum aestivum[C]//Sakamoto S. Proceedings of the 6th International Wheat Genetic Symposium.Kyoto， Maruzen， 1983：223-231.

[10]Aptekar R， Rejmánek M. The effect of sea-water submergence on rhizome bud viability of the introduced Ammophila arenaria and the native Leymus mollis in California [J]. Coastal Conserv.， 2000， 6： 107-111.

[11]齊津 H B， 彼特羅娃 K A. 禾本科植物的遠緣雜交[M]. 王懷名， 蔡起貴，譯. 北京：科學出版社， 1961：17-42.

[12]傅杰， 陳漱陽， 張安靜. 八倍體小濱麥的形成及細胞遺傳學研究[J]. 遺傳學報， 1993，20（4）： 317-323.

[13]Sharp P J， Kreis M， Shewry P. Location of β-amylase sequence in wheat and its relatives [J]. Theor. Appl. Genet.， 1988， 75： 289-290.

[14]Luan Y， Wang X G， Liu W H， et al. Production and identification of wheat-Agropyron cristatum 6P translocation lines [J].Planta， 2010， 232： 501-510.

[15]Devos K M， Gale M D. Comparative genetics in the grasses[J]. Plant Mol. Biol.， 1997， 35： 3-15.

[16]Leister D， Kurth J， Laurice D. RFLP and physical mapping of resistance gene homologues in rice （O. sativa） and barley （H.vulgare）[J]. Theor. Appl. Genet.， 1999， 98： 509-520.