林樹乾　李曉柳　宋敏訓(xùn)

摘要：采用影印培養(yǎng)法，以濃度為1/2MIC的五味子水煎液、五味子醇提物、百部水煎液、百部醇提物對(duì)耐環(huán)丙沙星大腸桿菌作用24 h，觀察作用前后大腸桿菌對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥性變化。結(jié)果表明：五味子水煎液、五味子醇提物、百部水煎液、百部醇提物對(duì)臨床分離耐藥菌株均無(wú)明顯耐藥性消除作用，五味子水煎液、五味子醇提物對(duì)人工誘導(dǎo)耐藥菌株有一定的耐藥消除作用。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌；五味子；百部；耐藥消除；環(huán)丙沙星

中圖分類號(hào)：S853.74文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2016）08-0134-03

AbstractThe tolerance of Escherichia coli to ciprofloxacin was observed after treated with 1/2MIC of Chinese Magnolcavine Fruit and Stemonae Radix extracts using replica plating. The extracts were obtained through decocted by water and ethanol respectively. The results showed that the Chinese Magnolcavine Fruit and Stemonae Radix extracts had no significant eliminating effects on drug tolerance of clinical isolates of E. coli， but the decocted and ethanol extracts of Chinese Magnolcavine Fruit had elimating effects of artificial induced drug-resistant strains in some extent.

KeywordsEscherichia coli；Chinese Magnolcavine Fruit；Stemonae Radix； Eliminating drug tolerance；Ciprofloxacin

隨著抗生素越來(lái)越廣泛應(yīng)用于臨床治療大腸桿菌病，臨床上出現(xiàn)了更多的大腸桿菌耐藥菌株，使得很多抗生素失去了原有的治療效果[1]。目前，人們?cè)谂Πl(fā)現(xiàn)新抗生素的同時(shí)，也在尋求消除細(xì)菌耐藥性的方法[2]。國(guó)內(nèi)亦有人開展了中藥消除細(xì)菌耐藥性的研究。鞠洪濤[3]報(bào)道大蒜油對(duì)大腸桿菌氨芐青霉素耐藥性有消除作用；王云等[4]用馬齒莧、金銀花提取液對(duì)綠膿桿菌PA11株R質(zhì)粒進(jìn)行體內(nèi)消除研究，結(jié)果顯示兩種藥作用24 h均未獲得消除作用，作用48 h和72 h R質(zhì)粒平均消除率馬齒莧為2.15%、金銀花為12.25%；康梅等[5]用三黃片對(duì)大腸桿菌多重耐藥株進(jìn)行質(zhì)粒消除試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)三黃片對(duì)耐藥質(zhì)粒有較強(qiáng)的消除作用；陳群等[6]在用黃芩與止痢靈對(duì)大腸桿菌R質(zhì)粒消除作用的研究中發(fā)現(xiàn)黃芩和止痢靈對(duì)大腸桿菌攜帶的R質(zhì)粒具有消除作用，其消除率為2.42%和2.14%；雷連成等[7]發(fā)現(xiàn)黃連提取物 （IT2）對(duì)大腸桿菌的部分耐藥性具有良好的抑制作用。

然而，關(guān)于中藥消除細(xì)菌耐藥性的研究尚處于探索階段，目前人們?nèi)栽谥铝τ诎l(fā)現(xiàn)更多更有效的對(duì)宿主本身無(wú)害的能消除細(xì)菌耐藥性的中藥制劑。本試驗(yàn)選擇五味子及百部不同提取物來(lái)消除自然的和人工誘導(dǎo)的大腸桿菌耐藥性，以期為篩選有效中藥消除劑提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1試驗(yàn)菌株本試驗(yàn)所用大腸桿菌天然耐藥菌株為臨床分離鑒定的雞源大腸桿菌耐環(huán)丙沙星菌株，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所提供。用于進(jìn)行人工誘導(dǎo)耐藥菌株為標(biāo)準(zhǔn)菌株CMCC44102，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2試驗(yàn)藥物環(huán)丙沙星藥敏片購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；五味子、百部均購(gòu)自山東建聯(lián)中藥店。

1.1.3試驗(yàn)試劑營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；LB培養(yǎng)基購(gòu)自O(shè)XOID公司。

1.1.4試驗(yàn)儀器pH測(cè)定儀、高壓鍋、電子天平、電爐、超凈工作臺(tái)、酒精燈、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1試驗(yàn)菌株準(zhǔn)備①菌株活化：吸取凍存菌株10 μL放入4 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)18 h，再將培養(yǎng)液用無(wú)菌生理鹽水稀釋至0.5麥?zhǔn)媳葷峁軠啙岫?，即菌液濃度?×108 CFU/mL，按照標(biāo)準(zhǔn)方法將其再稀釋1 000倍用于測(cè)定環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品溶液的MIC。

②臨床分離的天然耐藥菌株的耐藥性檢測(cè)：采用K-B法測(cè)定試驗(yàn)菌株對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥性，觀察含藥紙片周圍有無(wú)抑菌圈，并測(cè)量抑菌圈直徑。采用試管二倍稀釋法，以400 μg/mL環(huán)丙沙星水溶液為首濃度，倍比稀釋至0.78125 μg/mL，測(cè)定環(huán)丙沙星對(duì)試驗(yàn)菌株的MIC。

③標(biāo)準(zhǔn)菌株的人工耐藥誘導(dǎo)：采用肉湯稀釋法，以10 μg/mL環(huán)丙沙星水溶液為首濃度倍比稀釋至0.01953 μg/mL，測(cè)定環(huán)丙沙星對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC。以1/2MIC作為誘導(dǎo)耐藥濃度，然后逐步增加藥物濃度使其耐藥濃度達(dá)到10 μg/mL。

1.2.2中藥提取物的制備①水煎液的制備：取五味子、百部各100 g，加入十倍量蒸餾水浸泡0.5 h，煎煮1.0 h，過九號(hào)藥典篩，然后再加入十倍量蒸餾水煎煮1.0 h，過九號(hào)藥典篩，合并濾液，濃縮至每1 mL含生藥1 g，高壓滅菌后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

②醇提物的制備：取五味子、百部各100 g，加入十倍量80%乙醇浸泡0.5 h，加熱回流提取1.0 h，過九號(hào)藥典篩。向藥渣中再加入十倍量80%乙醇，將以上過程重復(fù)1次，合并濾液。45℃旋蒸去除乙醇，濃縮至每1 mL含生藥1 g，高壓滅菌后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3中藥提取物的耐藥消除試驗(yàn)①中藥提取物MIC測(cè)定：采用試管二倍稀釋法測(cè)定不同中藥提取物對(duì)受試菌株的MIC。取12支無(wú)菌試管編號(hào)（1～12號(hào)），各加入LB培養(yǎng)基1 mL，取1mL中藥原液置于第1號(hào)試管中，均勻混合，然后取出1 mL加入2號(hào)試管中，依次稀釋至10號(hào)管，棄去1 mL，在1～11號(hào)管中加入3×105 CFU/mL菌液1 mL，在12號(hào)管中僅加入1 mL中藥原液。第11號(hào)管作為不加藥物的菌液對(duì)照管，第12號(hào)管作為只加藥液不加菌液的藥物對(duì)照管。置于37℃恒溫振蕩器中培養(yǎng)18 h后觀察結(jié)果。

② 耐藥消除結(jié)果測(cè)定：選擇1/2MIC作為耐藥消除試驗(yàn)的藥物濃度，方法同1.2.3①，加入同樣濃度和體積的菌液，分別在37℃恒溫培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)后菌液加入LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)18 h，并將菌液稀釋至3×103 CFU/mL，用無(wú)菌玻璃棒均勻涂布在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)18 h，采用影印培養(yǎng)法[8]將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的菌落影印在含環(huán)丙沙星的培養(yǎng)基和不含環(huán)丙沙星的培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，對(duì)比觀察菌落消除結(jié)果。用無(wú)菌接種環(huán)勾取在含環(huán)丙沙星平板上消除而在不含環(huán)丙沙星平板對(duì)應(yīng)位置生長(zhǎng)的菌落，采用K-B法測(cè)定該類菌株對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥表型及MIC變化情況。

2結(jié)果與分析

2.1試驗(yàn)菌株的耐藥性

經(jīng)K-B法測(cè)定臨床分離的天然耐藥菌株對(duì)環(huán)丙沙星抑菌圈為0，標(biāo)準(zhǔn)株經(jīng)人工誘導(dǎo)耐藥后的抑菌圈為12.50 mm。試管二倍稀釋法測(cè)定環(huán)丙沙星對(duì)臨床分離的天然耐藥菌株的MIC為100 μg/mL，對(duì)未經(jīng)誘導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)菌株CMCC44102的MIC為0.039 μg/mL，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)人工誘導(dǎo)后的MIC為10 μg/mL。

2.2耐藥消除試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1中藥提取物的MIC測(cè)定結(jié)果采用試管二倍稀釋法測(cè)定不同中藥提取物對(duì)受試菌株的MIC，結(jié)果為五味子水煎液對(duì)受試菌株MIC均為0.0039 g/mL，五味子醇提物對(duì)受試菌株MIC均為0.0078 g/mL，百部水煎液對(duì)受試菌株MIC均為0.5 g/mL，百部醇提物對(duì)受試菌株MIC均為0.5 g/mL。

2.2.2中藥耐藥消除結(jié)果測(cè)定采用影印培養(yǎng)法觀察影印后菌落消失情況，挑選在普通平板上生長(zhǎng)但是在含環(huán)丙沙星平板對(duì)應(yīng)位置未生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行耐藥表型及MIC測(cè)定，結(jié)果顯示：五味子水煎液、五味子醇提取處理后的臨床分離菌株耐藥抑菌圈無(wú)變化，MIC值無(wú)變化，人工誘導(dǎo)耐藥菌株耐藥抑菌圈擴(kuò)大為14.24～14.50 mm，MIC值由10 μg/mL降至5 μg/mL，提示五味子可能有耐藥消除作用；百部水煎液和醇提取物對(duì)臨床分離耐藥菌株和人工誘導(dǎo)耐藥菌株均無(wú)耐藥消除作用。

3討論與結(jié)論

目前臨床上大腸桿菌病大多采用抗生素藥物進(jìn)行治療。喹諾酮類抗生素是近年來(lái)發(fā)展較快的一類人工合成抗菌藥物，其抗菌治療作用僅次于頭孢類。但是隨著其在我國(guó)集約化、規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)中被大量應(yīng)用，造成大腸桿菌耐喹諾酮類菌株越來(lái)越嚴(yán)重并廣泛傳播。

中藥抑制細(xì)菌耐藥性的研究近年來(lái)一直都是熱門話題，而且不同研究者通過試驗(yàn)證明，清熱解毒類藥物、清熱燥濕類藥物，如黃芩、黃連、黃柏、金銀花、馬齒莧、射干等，均有不同程度的耐藥消除作用[9，10]，但同種中藥在不同研究中有較大差異，這可能與中藥消除無(wú)標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定指標(biāo)和試驗(yàn)方法有關(guān)。而且目前中藥對(duì)細(xì)菌耐藥性消除的具體機(jī)制尚不明確，相關(guān)研究還處于起步階段，有大量工作要做。

本次試驗(yàn)為試圖尋找有效中藥消除劑的初步研究，試驗(yàn)過程中制作了改良影印培養(yǎng)工具，使得以后的篩選試驗(yàn)?zāi)苁r(shí)省力，節(jié)約資源。本試驗(yàn)初步證明了五味子對(duì)人工誘導(dǎo)菌株具有一定耐藥消除作用，但是其對(duì)臨床分離菌株并無(wú)耐藥消除作用，這可能與菌株耐藥性強(qiáng)弱有關(guān)，同時(shí)也可能與具體的耐藥消除機(jī)制不同有關(guān)。總之，本試驗(yàn)的過程及結(jié)果為尋找有效的細(xì)菌耐藥性消除劑打下基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]李淑梅，楊帆，劉興友.抗生素與動(dòng)物免疫研究進(jìn)展[J].畜禽業(yè)，2005（7）：36-37.

[2]方有儀，才讓措，錢俊棟.中藥消除細(xì)菌耐藥性研究進(jìn)展[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2014（4）：28-30.

[3]鞠洪濤.中草藥消除大腸埃希氏菌耐藥性及耐藥質(zhì)粒的研究[J].中國(guó)獸醫(yī)科技，2000，30（3）：27-29.

[4]王云，于軍，關(guān)顯智，等.馬齒莧、金銀花提取液對(duì)綠膿桿菌PA 11株R質(zhì)粒體內(nèi)消除作用的比較[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2000，12（4）：197-198.

[5]康梅，陳知行，許秀成，等.三黃片對(duì)大腸桿菌耐藥質(zhì)粒消除作用的研究[J].華西藥學(xué)雜志，1999，14（5-6）：406-408.

[6]陳群，王勝春.黃芩與止痢靈對(duì)大腸桿菌R質(zhì)粒消除作用的研究[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，1998，10（2）：80-82.

[7]雷連成，韓文瑜，段艷.大腸桿菌耐藥性抑制劑的初步研究[J].中國(guó)獸藥雜志，2004，38（2）：18-21.

[8]徐民俊，田小群，周世寧.一種改進(jìn)的平板影印工具及其應(yīng)用[J].微生物學(xué)報(bào)，2008，48（5）：657-660.

[9]蔣培余.中藥抑制劑逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性的研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008（10）：53-55.

[10]劉立新，劉芳萍，李睿，等.中藥消除細(xì)菌耐藥性的研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2008（5）：15-16.