譚小方 金華 徐麗 施蔚虹 李海波 丁家怡

摘要：目的 探討胚胎培養(yǎng)液氨基酸濃度與拉曼光譜特征對(duì)IVF-ET妊娠結(jié)局的影響表現(xiàn)。方法 選取163對(duì)行IVF-ET助孕的夫婦，按照是否妊娠分為移植妊娠組和移植未妊娠組，收集胚胎培養(yǎng)液檢測(cè)氨基酸代謝水平，行拉曼光譜分析。結(jié)果 移植妊娠組天冬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸水平均低于移植未妊娠組，丙氨酸-谷氨酰胺水平高于后者（P<0.05）；移植妊娠組胚胎培養(yǎng)液拉曼光譜信號(hào)與移植未妊娠組相比明顯增強(qiáng)（P<0.05）。結(jié)論 天冬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、丙氨酸-谷氨酰胺水平和拉曼光譜特征對(duì)胚胎移植后的妊娠結(jié)局有一定的影響。

關(guān)鍵詞：胚胎培養(yǎng)液；氨基酸濃度；拉曼光譜特征；IVF-ET妊娠結(jié)局；影響

隨著氨基酸代謝及光譜技術(shù)研究的不斷深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)氨基酸代謝水平、拉曼光譜與胚胎發(fā)育潛能之間有一定的關(guān)聯(lián)，可以作為檢測(cè)胚胎質(zhì)量的輔助方法[1]。本文探討了胚胎培養(yǎng)液氨基酸濃度與拉曼光譜特征對(duì)IVF-ET妊娠結(jié)局的具體影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 資料來源于2013年于南通婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心行IVF-ET助孕的163對(duì)不孕夫婦的臨床資料，在患者知情同意的原則和醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員審議批準(zhǔn)下，符合以下條件：①女方年齡≤35歲；②夫妻雙方無確診的染色體異常；③非反復(fù)種植失敗者（既往連續(xù)種植失敗的周期數(shù)﹤3）；④女方無宮腔鏡確診的宮腔畸形、粘膜下子宮肌瘤或子宮內(nèi)膜息肉；⑤女方無腹腔鏡或B超診斷的子宮內(nèi)膜異位癥或子宮腺肌病；⑥女方無確診的多囊卵巢綜合征（PCOS）；⑦促排卵過程中B超下未見明顯的輸卵管積液或?qū)m腔積液；⑧人絨毛膜促性腺激素（HCG）注射日內(nèi)膜厚度≥8mm，B超下內(nèi)膜無明顯異常回聲光團(tuán)。按照移植胚胎是否妊娠分為移植妊娠組和移植未妊娠組，移植妊娠組81例，年齡25～34歲，移植未妊娠組82例，年齡24～35歲。

1.2方法

1.2.1胚胎培養(yǎng) ①收集胚胎培養(yǎng)液：收集不同卵裂階段的胚胎培養(yǎng)液，以其體外培養(yǎng)的胚胎及培養(yǎng)液為研究對(duì)象，結(jié)合胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分系統(tǒng)，原核期評(píng)分采用Scott評(píng)分法，卵裂期胚胎評(píng)分及分級(jí)采用Gardner評(píng)分法。分別收集原核期、二細(xì)胞期、四細(xì)胞期、八細(xì)胞期、囊胚期胚胎培養(yǎng)液；②保存胚胎培養(yǎng)液：在經(jīng)形態(tài)學(xué)評(píng)估后，移出胚胎后，收集原核期、二細(xì)胞期、四細(xì)胞期、八細(xì)胞期、囊胚期胚胎培養(yǎng)液，于-80℃冰箱保存，待測(cè)。

1.2.2氨基酸成分分析 取胚胎培養(yǎng)液10μL，用流動(dòng)相10倍稀釋，用HPLC法分析20種游離氨基酸濃度。HPLC條件：C18反相色譜柱，4.0×125mm，粒徑5μm；流動(dòng)相A：10mmol/L Na2HPO4+pH 7.2 PBS緩沖液，流動(dòng)相：PBS+甲醇+乙腈（體積比50：35：15）；梯度洗脫：在0～20min內(nèi)，流動(dòng)相B以線性從0上升至100%；流速1.0ml/min；株溫：40℃；激發(fā)波長(zhǎng)340nm，檢測(cè)波長(zhǎng)450nm。

1.2.3拉曼光譜分析 冷凍的胚胎培養(yǎng)液室溫解凍后放置30 min以使標(biāo)本恒溫，毛細(xì)管吸取5μL標(biāo)本，置于拉曼顯微鏡下進(jìn)行拉曼光譜分析。實(shí)驗(yàn)條件：激發(fā)光：氬離子激光器，激發(fā)波長(zhǎng)514.5nm，激光輸出功率20mW，CCD檢測(cè)器，曝光時(shí)間20～60s，測(cè)量范圍：50～4000cm-1。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)描述采用（x±s），兩組定量資料比較采用t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)；單因素和多因素Logistic回歸分析氨基酸濃度與IVF妊娠結(jié)果的關(guān)系；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)臨床隨訪妊娠結(jié)局，分析妊娠組和非妊娠組不同階段胚胎培養(yǎng)液的光譜，及各胚胎期培養(yǎng)液氨基酸濃度分析，篩選出與妊娠相關(guān)的代謝成分指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1移植妊娠組和移植未妊娠組胚胎培養(yǎng)液中氨基酸水平對(duì)比 對(duì)比移植妊娠組和移植未妊娠組的10種氨基酸水平發(fā)現(xiàn)，移植妊娠組中天冬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸水平均低于移植未妊娠組，而且丙氨酸-谷氨酰胺水平高于后者，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2.2氨基酸水平對(duì)IVF-ET妊娠結(jié)局影響的回歸分析結(jié)果

Logistic回歸分析顯示IVF-ET妊娠結(jié)局與谷氨酰胺、丙氨酸、丙氨酸-谷氨酰胺呈負(fù)相關(guān)。見表2。

2.3移植妊娠組和移植未妊娠組胚胎培養(yǎng)液拉曼光譜對(duì)比 移植妊娠組胚胎培養(yǎng)液拉曼光譜信號(hào)與移植未妊娠組相比明顯增強(qiáng)，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

3 討論

IVF-ET自世界上首例試管嬰兒誕生以來便引起了全社會(huì)的廣泛關(guān)注，人類整體妊娠率也有所提高，但是IVF-ET妊娠成功率仍然不足30%，嚴(yán)重影響IVF-ET技術(shù)的臨床推廣[2]。研究發(fā)現(xiàn)，影響IVF-ET妊娠結(jié)局的因素是多方面的，雖然多個(gè)胚胎移植能夠顯著提高妊娠成功率，但是其所導(dǎo)致的產(chǎn)科并發(fā)癥也較多[3]。

本次研究結(jié)果顯示天冬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、丙氨酸-谷氨酰胺水平和拉曼光譜特征對(duì)妊娠結(jié)局都有一定的影響?？梢?，上述氨基酸代謝水平在一定程度上反映了胚胎的發(fā)育潛能，而且分析胚胎培養(yǎng)液的拉曼信號(hào)強(qiáng)度有助于提升胚胎質(zhì)量評(píng)估的準(zhǔn)確性。

參考文獻(xiàn)：

[1]鄧彬，李予，王文軍，等.胚胎培養(yǎng)液氨基酸濃度與體外受精-胚胎移植妊娠結(jié)局的關(guān)系[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)科學(xué)版），2013，34（6）：900.

[2]易艷紅，董梅，陳創(chuàng)奇，等.胚胎培養(yǎng)液中氨基酸濃度對(duì)選擇性單胚胎移植妊娠結(jié)局的影響[J].中華實(shí)用診斷與治療雜志，2014，28（12）：1163-1165.

[3]譚小方，金華，徐麗，等.IVF-ET周期中胚胎培養(yǎng)基的氨基酸代謝水平與妊娠結(jié)局的相關(guān)性研究[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2015，24（3）：186-190.

編輯/周蕓霏