武金日　閆軼鵬　吳隼

[摘要] 目的 定量檢測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病患者腦脊液循環(huán)DNA的含量并探討其臨床意義。 方法 收集2014年8月～2015年7月間的急性白血病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病治療前、后患者各20例；留取同期非惡性血液腫瘤患者20例為對(duì)照組，微量DNA提取試劑盒提取腦脊液循環(huán)DNA，SYBR green熒光染色法測(cè)定腦脊液循環(huán)DNA濃度。結(jié)果 1.腦脊液循環(huán)DNA電泳條帶在100～1000 bp之間。2.中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病組循環(huán)DNA濃度為[（330.97±35.49）ng/mL]、急性白血病組循環(huán)DNA濃度為[（79.18 ±2.22）ng/mL]，均明顯高于非惡性血液病組腦脊液循環(huán) DNA 濃度[（7.83 ±1.85）ng/mL]（P=0.000；P=0.000）；中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病患者治療緩解后腦脊液循環(huán)DNA濃度[（141.77±37.56）ng/mL]明顯低于治療前組循環(huán)DNA濃度[（330.97±35.49）ng/mL]（P=0.000）。 結(jié)論 腦脊液循環(huán)DNA水平與中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病細(xì)胞浸潤(rùn)具有明顯相關(guān)性，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病早期診斷及病情監(jiān)測(cè)方面有一定的臨床價(jià)值。

[關(guān)鍵詞] 循環(huán)DNA；中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血?。荒X脊液；腫瘤標(biāo)志物

[中圖分類號(hào)] R733.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）07-0019-03

[Abstract] Objective To quantify the circulating DNA in cerebrospinal fluid（CSF） from patients with CNSL and evaluate its potential clinical value. Methods Cerebrospinal fluid samples were collected from 20 patients with CNSL before Intrathecal chemotherapy， 20 patients with CNSL after Intrathecal chemotherapy，20 acute leukemia patients and 20 patients without hematological malignancy from August 2014 to July 2015. The cerebrospinal fluid DNA was extracted by commercial kit and detected by fluorescntmeter. Results 1.Circulating DNA electrophoresis bands were between 100～1000 bp. 2.Statistical significance（P=0.000； P=0.000） in mean circulating cerebrospinal fluid DNA levels were found between patients without hematological malignancy[（7.83±1.85）ng/mL] and patients with acute leukemia [（79.18±2.22）ng/mL]，with CNSL patients were[（330.97±35.49）ng/mL]. Circulating DNA levels of acute leukemia without CNSL after chemotherapy[（141.77±37.56）ng/mL] were less than without chemotherapy [（330.97±35.49）ng/mL]（P=0.000）. Conclusion The Circulating DNA levels significant correlated with central nervous system leukemia，it can initially predict the metastasis potential and prognosis of those CNSL patients.

[Key words] Circulating DNA； Central Nervous System Leukemia； Cerebrospinal fluid； Tumor marker

中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病系白血病細(xì)胞浸潤(rùn)蛛網(wǎng)膜或蛛網(wǎng)膜鄰近組織所致，是白血病復(fù)發(fā)的主要根源。中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病早期無明顯臨床癥狀，主要依靠發(fā)病后腦脊液沉渣鏡檢診斷。該方法早期診斷率低。針對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病的少創(chuàng)傷、簡(jiǎn)便可靠以獲得早期診斷成為研究目標(biāo)。近年來循環(huán)DNA做為一種新型的腫瘤標(biāo)志物在腫瘤疾病方面的研究[1，2]成為了熱點(diǎn)。健康人的循環(huán)DNA主要來源于細(xì)胞凋亡，而惡性腫瘤患者的循環(huán)DNA主要由腫瘤細(xì)胞分泌及壞死、凋亡、微轉(zhuǎn)移灶所釋放[3]。故檢測(cè)循環(huán)DNA含量用于惡性腫瘤早期診斷與治療效果判斷成為可能。定量檢測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病患者腦脊液循環(huán)DNA的含量，旨在探討腦脊液循環(huán)DNA含量在中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病臨床應(yīng)用方面的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年8月～2015年7月間急性白血病患者20例（男11例，女9例，平均年齡36.0歲），中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病治療前患者20例（男12例，女8例，平均年齡37.6歲）及治療后患者（男11例，女9例，平均年齡37.3歲）20例；同期非惡性血液腫瘤患者20例（男11例，女9例，平均年齡38.2歲）為對(duì)照組。各組一般資料具有可比性。急性白血病診斷分型參照世界衛(wèi)生組織（WHO）2008年公布的造血與淋巴系統(tǒng)腫瘤的診斷分型標(biāo)準(zhǔn)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病診斷標(biāo)準(zhǔn)：①頭部MR/CT（平掃+增強(qiáng)）浸潤(rùn)或塊狀病變；②能除外其他原因的顱神經(jīng)癱瘓及視網(wǎng)膜浸潤(rùn)，及CSF、MR/CT未見異常，③CSF中有幼稚細(xì)胞，且WBC>5×10-9/L，除外腰穿損傷。診斷成立須符合以上至少一項(xiàng)。三聯(lián)鞘注防治中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血?。ㄋ幬飫┝浚旱厝姿?0 mg+阿糖胞苷50 mg+甲氨蝶呤15 mg）。入組病例均應(yīng)排除其他惡性腫瘤，無類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等免疫性疾病，無外傷、肝腎等臟器損傷性疾病。

1.2 標(biāo)本采集

急性白血病患者緩解后腰穿留取腦脊液1.5 mL，中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病患者分別于確診時(shí)與治療緩解后腰穿留取腦脊液1.5 mL，非惡性血液腫瘤患者腦脊液常規(guī)檢查留取1.5 mL。4℃、3000 r/min離心10 min，EP管收集上清液-80℃低溫保存。

1.3 循環(huán)DNA提取

按照QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒（德同Qiagen公司）說明書所述方法提取循環(huán)DNA。紫外分光光度計(jì)NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó)）初步檢測(cè)提取純度及效率，瓊脂糖凝膠電泳分析循環(huán)DNA的完整性。

1.4 DNA定量

取1 μL純化的腦脊液DNA，與等體積Picogreen熒光染料均勻混合，應(yīng)用Qubit2.0熒光儀測(cè)定熒光值，計(jì)算DNA含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多個(gè)組樣本均數(shù)之間比較用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦脊液中循環(huán)DNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

循環(huán)DNA瓊脂糖凝膠片電泳，染色后紫外燈下直接觀察循環(huán)DNA片段大小分布。其中CNSL組、CNSL治療后組可見清晰條帶。對(duì)照DNA mark電泳結(jié)果，循環(huán)DNA電泳條帶在100～1000 bp之間。見圖1。

2.2 對(duì)照組、急性白血病組患者腦脊液DNA含量

中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病組循環(huán)DNA濃度為[（330.97±35.49）ng/mL]、急性白血病組循環(huán)DNA濃度為[（79.18±2.22）ng/mL]，均明顯高于非惡性血液病組腦脊液循環(huán) DNA 濃度[（7.83±1.85）ng/mL]差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病患者治療緩解后腦脊液循環(huán)DNA濃度[（141.77±37.56）ng/mL]明顯低于治療前組循環(huán)DNA濃度[（330.97±35.49）ng/mL]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病患者治療緩解后腦脊液循環(huán)DNA濃度[（141.77±37.56）ng/mL]仍明顯高于急性白血病組循環(huán)DNA濃度[（79.18±2.22）ng/mL]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。

3 討論

循環(huán)DNA在1948年被發(fā)現(xiàn)，隨后發(fā)現(xiàn)腫瘤患者的循環(huán)DNA與其腫瘤組織表現(xiàn)出共同的遺傳學(xué)性狀[4-8]。對(duì)循環(huán)DNA的來源研究表明腫瘤患者的循環(huán) DNA 主要來源為腫瘤細(xì)胞主動(dòng)分泌、壞死及凋亡、微轉(zhuǎn)移灶等釋放[3]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病惡性增殖的白血病細(xì)胞及化療藥物導(dǎo)致的細(xì)胞壞死和凋亡，都可改變者腦脊液中的循環(huán) DNA，因此腦脊液循環(huán)DNA的檢測(cè)為我們?cè)缙谠\斷及治療效果監(jiān)測(cè)提供新的思路。

本研究循環(huán)DNA電泳分子量介于100 bp～1000 bp之間，與Stroun M[9]的研究結(jié)果相似。原因可能循環(huán)DNA的來源有關(guān)。健康人循環(huán)DNA主要來源于細(xì)胞凋亡，該來源的循環(huán)DNA片段較短，一般小于200 bp。腫瘤患者循環(huán)DNA則主要由腫瘤細(xì)胞壞死產(chǎn)生，其電泳出更長(zhǎng)的循環(huán)DNA片段[3]。多種腫瘤患者循環(huán)DNA水平高于健康人，并表現(xiàn)出與腫瘤細(xì)胞相同的生物學(xué)特性[5-7]。目前為止，循環(huán)DNA來源機(jī)制仍不十分清楚。

我們采用Picogreen 熒光染色法[8]對(duì)循環(huán) DNA 定量檢測(cè)。結(jié)果顯示患者中樞浸潤(rùn)后腦脊液循環(huán)DNA水平明顯升高。既往研究表明多種實(shí)體腫瘤患者循環(huán)DNA 水平高于健康人[5-7，9]。關(guān)于白血病患者的研究也顯示循環(huán)DNA水平升高[10，11]。Leon等[12]的研究顯示腫瘤負(fù)荷高的患者循環(huán)DNA水平更高。惡性血液病循環(huán) DNA 水平高于實(shí)體腫瘤，可能與體液中腫瘤細(xì)胞多有關(guān)，提示循環(huán)腫瘤細(xì)胞與循環(huán) DNA 有一定的相關(guān)性，而循環(huán)腫瘤細(xì)胞與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)[13，14]。國(guó)內(nèi)惡性血液病循環(huán) DNA研究較少，孫開勝[15]等采用 SYBR green 熒光染色法對(duì)急性白血病患者血循環(huán) DNA 定量分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)病后循環(huán)DNA升高。本研究比較急性白血病患者中樞浸潤(rùn)前后腦脊液循環(huán) DNA 水平，發(fā)現(xiàn)兩者之間有顯著差異，結(jié)合急性白血病特點(diǎn)分析，導(dǎo)致本結(jié)果的可能有以下原因：急性白血病細(xì)胞定植中樞大量增殖導(dǎo)致循環(huán)DNA釋放；血腦屏障阻止以蛋白結(jié)合形式的循環(huán)DNA進(jìn)入外周血，避免被肝臟迅速代謝[8]。

化療后腫瘤負(fù)荷降低，腫瘤細(xì)胞來源的循環(huán) DNA隨之減少，循環(huán) DNA 水平下降[16]。我們比較中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病患者化療前、后腦脊液循環(huán)DNA 水平，發(fā)現(xiàn)治療后較治療前明顯減少，治療效果好的患者更明顯，顯示出其與病情變化明顯相關(guān)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病患者治療后腦脊液循環(huán)DNA水平仍高于未合并中樞浸潤(rùn)患者，考慮化療并不能完全清除腫瘤細(xì)胞，殘留的白血病細(xì)胞仍能增加循環(huán)DNA的水平，這也可能與中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病即使治療后仍多見復(fù)發(fā)有關(guān)。

綜上所述，定量檢測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病患者診治過程中循環(huán)DNA水平變化，中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病發(fā)病后腦脊液循環(huán)DNA水平顯著升高，治療后明顯下降。顯示出對(duì)疾病的早期診斷及病情監(jiān)測(cè)有一定的指導(dǎo)意義。通過對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病患者腦脊液循環(huán)DNA的檢測(cè)，我們可以更早診斷及預(yù)測(cè)病情變化，具有較大的可行性。對(duì)循環(huán)DNA的研究，有可能為中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病的早期診斷、病情監(jiān)測(cè)提供特異性好、靈敏度高的新的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

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（收稿日期：2015-11-24）