司倩倩 臧德奎 傅劍波 劉濟(jì)祥

摘 要：通過測(cè)定種子活力、種皮透水性、不同部位浸提液的生物活性，研究了粗榧種子休眠原因，并采用低溫層積打破休眠。結(jié)果表明：粗榧種子生活力為90%，具備較大的發(fā)芽潛力；粗榧種皮及胚乳（含胚）中均含有萌發(fā)抑制物質(zhì)，且胚乳（含胚）抑制強(qiáng)度大于種皮；機(jī)械束縛和萌發(fā)抑制物的存在是造成種子休眠的原因，采用低溫層積處理可以打破種子休眠。

關(guān)鍵詞：粗榧； 休眠原因； 機(jī)械束縛； 萌發(fā)抑制物； 低溫層積

中圖分類號(hào)：S664.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2016）05-0042-04

Abstract The causes of seed dormancy of Cephalotaxus sinensis （Rehd. & Wils.） Li were investigated through detecting seed viability， water permeability of seed coat and bioactivity of extracts from different parts of seeds. And the cold stratification was used to break dormancy. The results showed that the seed viability was 90% with greater germination potential. There were germination inhibitors in seed coat and endosperm （including embryo）， and the inhibiton of endosperm （including embryo） was stronger than that of seed coat. The mechanical restraint and the existence of germination inhibitors were the causes for seed dormancy. Cold stratification was an effective way to break seed dormancy of Cephalotaxus sinensis.

Key words Cephalotaxus sinensis （Rehd. & Wils.） Li； Dormant cause； Mechanical restraint； Germination inhibitor； Cold stratification

粗榧[Cephalotaxus sinensis （Rehd. & Wils.） Li]又名中國粗榧、粗榧杉，為三尖杉科三尖杉屬植物。粗榧屬于第三紀(jì)孑遺植物，是我國特產(chǎn)樹種[1]，自然分布于長江流域及以南地區(qū)[2]，但具有較強(qiáng)的耐寒性，在北京可以露地越冬。粗榧用途廣泛，可在園林中作觀賞植物栽培，經(jīng)修剪造型可制作盆景。此外，粗榧中含有多種生物活性物質(zhì)，在醫(yī)學(xué)[3，4]、毒理學(xué)[5，6]、植物化學(xué)[7]等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。生產(chǎn)上一般采用播種繁殖，但成熟種子有休眠特性[8]，落地后翌年或第三年才能發(fā)芽[9]，給林業(yè)生產(chǎn)帶來諸多不便。本研究對(duì)粗榧生活力、種皮透水性、不同部位浸提液生物活性進(jìn)行測(cè)定，以期掌握其種子休眠原因并探索打破休眠的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用粗榧種子采自河南伏牛山成年樹上。在水中浸泡3～5 d，每天換水，反復(fù)搓洗以去掉假種皮，并用清水淘洗，得到純凈種子，陰干，放在低溫干燥處保存。

種子浸提液生物測(cè)定所用白菜種子為北京益豐惠農(nóng)農(nóng)業(yè)科技研究所的“四季小白菜”，純度95.0%，凈度98.0%，發(fā)芽率>85%，含水量約為8.0%。

1.2 方法

1.2.1 生活力測(cè)定 采用TTC染色法快速測(cè)定種子生活力[10]。

1.2.2 無菌條件下種子萌發(fā)試驗(yàn) 先將浸泡48 h的種子用1‰升汞消毒4 min，75%醫(yī)用酒精消毒7 min，將種子分為兩組，其中一組去掉外種皮，在無菌條件下將種子接種在MS培養(yǎng)基上，然后放在恒溫培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng)，光照時(shí)間為12 h·d^-1，每組接種100粒種子，定期觀察發(fā)芽和生長情況，30 d統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。

1.2.3 種皮透水性測(cè)定 采用稱重法：分別隨機(jī)抽取完整種子、破皮種子（將種皮敲出一條裂縫）各50粒，稱重后放在 25℃恒溫培養(yǎng)箱中，用去離子水浸泡。每隔2 h取出種子（12 h后，每12 h取一次），用吸水紙吸干表面水分，在 1/1 000 電子天平上稱重，直至種子重量不再變化為止。每處理設(shè)置 3 次重復(fù)，計(jì)算其吸水率。

吸水率（%）=（吸水后質(zhì)量-吸水前質(zhì)量）/吸水前質(zhì)量×100

1.2.4 種子浸提液生物測(cè)定 參考王小平等[11]的提取方法。準(zhǔn)確稱取粗榧種皮、胚乳（胚）各2.0 g，用80%甲醇研磨，定容至50 mL，于4℃培養(yǎng)箱中振蕩提取48 h，過濾，重復(fù)1次。35℃減壓濃縮后用去離子水定容至20 mL，分別稀釋成濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g·mL^-1的溶液，在培養(yǎng)皿中加入各濃度提取液5 mL，各放50粒提前浸泡2 h的白菜種子，在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，以同體積蒸餾水為對(duì)照，設(shè)置3次重復(fù)，48 h后記錄白菜種子的發(fā)芽率（以胚根露出3 mm為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)）。

1.2.5 層積催芽 采用低溫層積方法：種子經(jīng)0.3%高錳酸鉀消毒30 min后，用30～40℃溫水浸泡48 h，然后將沙子與種子以3∶1的比例混勻（層積所用沙含水量保持在 60%左右），埋藏在背風(fēng)向陽處，埋藏深度為50 cm。定期測(cè)定發(fā)芽率。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子形態(tài)特征與休眠的關(guān)系

粗榧種子橢圓形，外種皮褐色，具有極淺的雕刻狀花紋，骨質(zhì)，硬度較大，對(duì)種子萌發(fā)產(chǎn)生機(jī)械束縛。由種子發(fā)芽試驗(yàn)可知，在25℃光照恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d后，完整種子和去殼種子均未發(fā)芽，繼續(xù)培養(yǎng)30 d，種子出現(xiàn)發(fā)霉現(xiàn)象，但均未有萌發(fā)跡象。TTC法測(cè)定種子生活力結(jié)果表明，經(jīng)TTC染色后，大部分胚和胚乳被染色，染色率達(dá)到90%以上，即種子生活力達(dá)到90%以上。但發(fā)芽試驗(yàn)中，種子均不能萌發(fā)，說明種子存在深度休眠現(xiàn)象。

2.2 種皮透水性測(cè)定

由圖1可知，完整種子和破殼種子的含水量變化趨勢(shì)大致相同，在處理前期，含水量均有不同程度增加。破殼種子36 h內(nèi)為快速吸水期，含水量達(dá)到37.62%，約占總吸水量的86.68%，36～96 h吸水速度減慢，占總吸水量的12.97%，96 h以后逐漸趨于飽和；完整種子60 h內(nèi)吸水相對(duì)較快，含水量達(dá)到36.27%，占總吸水量的83.86%，60～96 h吸水速度減慢，96 h之后逐漸達(dá)到飽和狀態(tài)。吸水飽和之前，破殼種子的吸水速度明顯高于完整種子，達(dá)到飽和狀態(tài)時(shí)，兩種處理的種子含水量基本一致，這表明粗榧骨質(zhì)種皮對(duì)吸水透性有一定的阻礙作用，但不是休眠的主要原因。

2.3 種子浸提液生物測(cè)定

由表1可知，各濃度浸提液處理的白菜種子發(fā)芽率與對(duì)照的差異均達(dá)到了極顯著水平（P<0.01），表明粗榧種皮、胚乳（胚）均對(duì)白菜種子萌發(fā)有抑制作用，且抑制強(qiáng)度與浸提液濃度呈正相關(guān)。種皮與胚乳（胚）對(duì)白菜種子發(fā)芽率的抑制程度差異顯著。浸提液濃度為0.02 g·mL^-1時(shí)，種皮浸提液處理的白菜發(fā)芽率為45.33%，比對(duì)照減少52.45%，胚乳（胚）發(fā)芽率為26.67%，比對(duì)照減少72.02%，發(fā)芽率僅比濃度為0.06 g·mL^-1的種皮浸提液處理的種子高不到2%；當(dāng)浸提液濃度為0.10 g·mL^-1時(shí)，提取液對(duì)白菜種子的抑制作用最強(qiáng)，種皮提取液處理的白菜種子發(fā)芽率為8.00%，比濃度為0.06 g·mL^-1時(shí)胚乳（胚）提取液處理的種子低14.26%，此濃度時(shí)，胚乳（胚）提取液處理的白菜種子發(fā)芽率為3.33%，比對(duì)照減少96.51%。這表明胚乳（胚）中的抑制物抑制強(qiáng)度大于種皮。

2.4 層積對(duì)種子發(fā)芽率的影響

如表2所示，層積30、60 d時(shí)，種子沒有萌動(dòng)跡象；隨層積時(shí)間的延長，發(fā)芽率從層積90 d的6.78%上升到150 d時(shí)的41.55%。層積過程中，種子含水量隨層積時(shí)間延長而不斷增加，層積150 d時(shí)，含水量由層積30天的34.20%增加到40.48%。表明種子發(fā)芽不僅與層積時(shí)間密切相關(guān)，還與含水量有一定聯(lián)系，種子只有達(dá)到或接近水飽和狀態(tài)時(shí)才開始萌發(fā)。層積過程中，隨著時(shí)間延長，種子腐爛數(shù)量不斷增加，層積150 d時(shí)爛種率高達(dá)17.78%。

3 結(jié)論與討論

有些種子的種皮由于堅(jiān)硬、結(jié)構(gòu)致密或具有很厚的蠟質(zhì)層，導(dǎo)致種皮透氣、透水性差，甚至產(chǎn)生束縛作用，若胚不能產(chǎn)生足夠的推力突破這些組織，種子便不會(huì)萌發(fā)。野茉莉堅(jiān)硬厚實(shí)的種皮是影響其萌發(fā)的機(jī)械障礙[12]；抑制物質(zhì)普遍存在于休眠的種子中，抑制物質(zhì)的存在是導(dǎo)致種子休眠的一個(gè)重要因素。自然界中很多植物如滇重樓[13]、藏茴香[14]、血皮槭[15]等種子均含有萌發(fā)抑制物質(zhì)。

本研究中，粗榧種子種皮骨質(zhì)，堅(jiān)硬致密，對(duì)種子產(chǎn)生機(jī)械阻力，導(dǎo)致種子不易萌發(fā)；經(jīng)破殼處理后，吸水率大于完整種子，但兩者飽和含水量無顯著差異，且兩者達(dá)到飽和含水量所需時(shí)間較短（120 h），與粗榧長達(dá)2～3年的休眠期相比可以忽略不計(jì)，說明粗榧種子雖然具有一定透性障礙，但不是種子休眠的主要原因。這與劉成功等[16]的研究結(jié)果相一致。種子提取液處理的白菜種子發(fā)芽率均小于對(duì)照，且胚乳（胚）提取液處理的白菜種子發(fā)芽率低于種皮，表明粗榧種皮和胚乳（胚）中均含有抑制物質(zhì)，且胚乳（胚）含量大于種皮，種子中含有內(nèi)源抑制物是造成種子休眠的主要原因。

層積是一種常用的打破休眠的有效方法，尤其對(duì)因含萌發(fā)抑制物質(zhì)而休眠的種子效果顯著[17]。本研究中，低溫層積處理能顯著影響粗榧種子發(fā)芽率，在一定低溫條件下，適當(dāng)延長處理時(shí)間，能有效提高粗榧種子發(fā)芽率。在層積過程中，隨著時(shí)間延長，爛種率也不斷提高，因此應(yīng)將其他打破種子休眠的方法如酸蝕、外源激素處理等同低溫層積結(jié)合使用，以縮短層積時(shí)間，減少爛種率。但哪種處理組合最適合粗榧種子，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

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