蘭衛(wèi) 郭玉婷 陳陽(yáng) 段沐含 耿直 倪健

摘要：目的研究洋甘菊提取物對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞體外增值抑制的作用。方法洋甘菊提取物95%乙醇提取并純化，得到澄清的藥物溶液后，進(jìn)行細(xì)胞體外給藥實(shí)驗(yàn)。采用CCK-8法測(cè)定不同濃度不同時(shí)間下洋甘菊提取物作用后Hela細(xì)胞存活率。結(jié)果藥物濃度為670μg/mL時(shí)，Hela細(xì)胞抑制率為29.35%。當(dāng)最高藥物濃度達(dá)到1500μg/mL時(shí)，Hela細(xì)胞抑制率為82.18%。隨著藥物濃度的增加，Hela細(xì)胞抑制率呈明顯上升趨勢(shì)。結(jié)論維藥洋甘菊提取物對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用。

關(guān)鍵詞：洋甘菊；宮頸癌；Hela細(xì)胞；細(xì)胞增殖；抑制

中圖分類號(hào)：R285.6文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1007-2349（2016）05-0054-02

德國(guó)洋甘菊（Matricaria chamomilia）又稱母菊，維吾爾語(yǔ)稱“巴木乃”，是新疆特色地產(chǎn)藥材[1]。根據(jù)近年來(lái)的藥理學(xué)研究表明，發(fā)現(xiàn)它有鎮(zhèn)靜、止痛及改善癌癥病人癥狀等作用[2]。

宮頸癌是一種嚴(yán)重危害婦女健康和生命的惡性腫瘤[3]。本實(shí)驗(yàn)組采用人宮頸癌Hela細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停芯垦蟾示仗崛∥矬w外抗宮頸癌的抑制活性，擴(kuò)展洋甘菊的臨床用途。

1材料

1.1藥材洋甘菊于2015年采集自新疆和田地區(qū)策勒縣策勒鄉(xiāng)，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中藥系中藥資源教研室盛萍教授鑒定為德國(guó)洋甘菊（Matricaria chamomilia）的頭狀花序。

1.2儀器酶標(biāo)儀；顯微鏡，離心機(jī)，移液槍，超凈工作臺(tái)（BCM-1300A）；CO2培養(yǎng)箱（HERAcell 150i）。

1.3試劑0.25%胰酶（批號(hào)：140609，北京協(xié)和細(xì)胞資源中心）；胎牛血清（批號(hào)：20130511，蘭州百靈生物技術(shù)有限公司）；DMEM培養(yǎng)液（批號(hào)：201305，Thermo Fisher公司）；CCK-8（批號(hào)：JA611，DOJINDO laboratories）。

1.4細(xì)胞人宮頸癌Hela細(xì)胞株由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所贈(zèng)予。

2方法

2.1洋甘菊提取物的提取洋甘菊干燥花序2.0kg，加10倍量95 %乙醇浸泡30 min，加熱回流2次，每次60 min，過(guò)濾，合并兩次濾液，干燥，得到洋甘菊提取物。

2.2洋甘菊提取物藥物溶液的配制洋甘菊提取物為粗提物，以DMSO助溶，用完全培養(yǎng)液稀釋（DMSO含量≤0.5%），配制成每mL含2 mg洋甘菊提取物的溶液，完全溶解后于離心機(jī)中離心，轉(zhuǎn)速12000 rpm，離心時(shí)間5 min，上清液經(jīng)0.22 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾，即得用于細(xì)胞給藥的澄清藥物溶液。

2.3細(xì)胞抑制率測(cè)定采用參考文獻(xiàn)的方法[4]，選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔接種3000 個(gè)/100 μL細(xì)胞懸液，24 h后給藥，根據(jù)前期預(yù)試結(jié)果，分別設(shè)9個(gè)濃度受試組（能反映濃度與療效的量-效關(guān)系）、陽(yáng)性對(duì)照組、細(xì)胞對(duì)照組和正常組，陽(yáng)性對(duì)照組加入順鉑（濃度為20 μg/mL）。同時(shí)，考察細(xì)胞毒性試驗(yàn)，加入上述不含藥物的DMSO溶液，作為細(xì)胞對(duì)照組；加入正常培養(yǎng)基，作為正常組。再培養(yǎng)72 h，然后在細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μL CCK-8，在37℃環(huán)境中孵育4 h，然后測(cè)定其450 nm吸光度，獲取受試藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制率和IC50[5]。

2.4Hela細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察根據(jù)上述細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)，取12孔板，加入濃度為890、670 μg/mL的藥物，觀察藥物對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響。參照相關(guān)文獻(xiàn)[6]，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔接種50000個(gè)/2 mL，培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)組分別加入加入濃度為890、670 μg/mL的洋甘菊提取物，對(duì)照組加入空白培養(yǎng)液，培養(yǎng)72 h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。

3結(jié)果

3.1洋甘菊提取物對(duì)Hela細(xì)胞的增殖抑制作用采用CCK-8法測(cè)定分別加入1500、1200、1000、890、670、460、330、180、95 μg/mL不同濃度藥物溶液作用72 h后Hela細(xì)胞的存活率，見(jiàn)圖1。與對(duì)照組未經(jīng)處理的Hela細(xì)胞相比，藥物濃度為為890 μg/mL時(shí)，Hela細(xì)胞抑制率為51.16%。當(dāng)最高藥物濃度達(dá)到1500 μg/mL時(shí)，Hela細(xì)胞抑制率為82.18%。相同作用時(shí)間增加給藥濃度，細(xì)胞抑制率明顯上升。結(jié)果表明，洋甘菊提取物對(duì)Hela細(xì)胞的增殖有顯著抑制作用。其中，IC50為890 μg/mL，對(duì)Hela細(xì)胞抑制率為51.16%。同時(shí)，將DMSO以完全培養(yǎng)液稀釋后，DMSO的含量同給藥組，經(jīng)實(shí)驗(yàn)觀察，DMSO對(duì)照組各濃度對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯抑制作用，并與正常組接近。

3.2Hela細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察參照相關(guān)文獻(xiàn)[6]，觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，見(jiàn)圖2。

4討論

本研究采用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞存活率，結(jié)果表明，洋甘菊提取物可明顯抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖。本實(shí)驗(yàn)對(duì)Hela細(xì)胞的活性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，Hela細(xì)胞的存活率隨洋甘菊提取物給藥濃度的增加而減小；綜上所述，洋甘菊提取物能夠抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖。

洋甘菊中含多種活性成分，最為重要成分的是黃酮類成分及其苷類成分，主要有芹菜素、木犀草素和槲皮素、木犀草苷等[7-8]，蘭衛(wèi)等[9-10]測(cè)定了芹苷元-7-葡萄糖苷和總皂苷的含量。

胡繼松等[11]研究了芹菜中五種成分對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2、白血病細(xì)胞株HL-60的抑制效果。結(jié)果表明，芹菜素（98%）和芹菜醇提物（黃酮含量40%）樣品對(duì)HepG2和HL-60有一定的抑制作用，而試驗(yàn)中芹菜粗黃酮（黃酮含量70%）、芹菜苷（98%）、3-甲氧基芹菜苷（98%）對(duì)HepG2和HL-60這兩種腫瘤細(xì)胞均無(wú)明顯抑制效果。

天然藥物通過(guò)多種途徑對(duì)腫瘤進(jìn)行預(yù)防和治療，抗氧化作用是途徑之一[12]。韓松林等報(bào)道了洋甘菊具有抗氧化作用[13]。夏娜等報(bào)道了洋甘菊中多糖與黃酮粗提物抗氧化及抑制亞硝化作用[14]。由于洋甘菊多成分，多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，其提取物抗腫瘤作用機(jī)制廣泛，洋甘菊抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和可能的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，其抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖作用的“藥—效”對(duì)應(yīng)關(guān)系有待進(jìn)一步明確。

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