□莫丹 付超強(qiáng) 李萍萍 馮浩 (林州中農(nóng)穎泰生物肽有限公司)

腸桿菌肽的研究進(jìn)展與應(yīng)用

□莫丹 付超強(qiáng) 李萍萍 馮浩 (林州中農(nóng)穎泰生物肽有限公司)

1 腸桿菌肽概述

腸桿菌肽最早是由1993年美國普林斯頓大學(xué)從腸道細(xì)菌中分離出一類分子量小于2.5KD(千道爾頓），有著索套狀結(jié)構(gòu)的抗菌多肽，其結(jié)構(gòu)超級(jí)穩(wěn)定，對酸、堿、溫度都有很好的耐受性，并將其命名為（Lasso Peptides）。

腸桿菌肽是由腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)生的抑制大腸桿菌和相關(guān)病株的經(jīng)典細(xì)菌素抗菌肽。它是由腸桿菌屬的細(xì)菌產(chǎn)生的一類小分子量的抗菌肽，由于其抑菌能力強(qiáng)，引起國內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)的廣泛關(guān)注。

其對大腸桿菌、沙門氏菌以及志賀氏菌具有很強(qiáng)的殺滅和抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，腸桿菌肽這種索套結(jié)構(gòu)對于抗菌功能非常重要，用氨基酸合成的辦法合成的直鏈多肽沒有生物活性，而結(jié)構(gòu)的改變都會(huì)造成抗菌活性的下降或消失。我們利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)在植物乳桿菌中實(shí)現(xiàn)了高效生產(chǎn)。

2 腸桿菌肽作用機(jī)制

目前認(rèn)為，腸桿菌肽主要是通過兩種方式抑制病原微生物。

2.1 通過抑制RNA聚合酶活性來干擾細(xì)菌mRNA以及蛋白質(zhì)的合成。

2.1.1 RNA聚合酶(RNAP)是細(xì)菌基因表達(dá)的關(guān)鍵酶，是一種極其復(fù)雜的分子機(jī)器。RNAP具有催化作用的核心部分由亞基 α2ββ‘ω組成，分子量為400KD。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)RNAP的β亞基發(fā)生突變后，其對腸桿菌肽產(chǎn)生耐受性，從而確定其靶位點(diǎn)為RNAP。

2.1.2 通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)發(fā)現(xiàn)，腸桿菌肽通過與二級(jí)通道結(jié)合發(fā)揮抑制作用，這種二級(jí)通道是由主要活性位點(diǎn)通道分支出來的次級(jí)通道，核苷酸底物通過這個(gè)通道進(jìn)入到RNA聚合酶的作用位點(diǎn)。而腸桿菌肽與RNAP次級(jí)通道的結(jié)合會(huì)阻礙核苷酸進(jìn)入酶的活性位點(diǎn)，從而抑制mRNA的形成和進(jìn)一步蛋白質(zhì)的合成。

2.2 通過改變細(xì)胞膜的通透性，從而使細(xì)菌細(xì)胞膜破碎，內(nèi)容物外滲，病原細(xì)菌死亡。

2.2.1 腸桿菌肽對指數(shù)期生長的沙門氏菌和大腸桿菌的作用。加入1uM或者0.05uM的腸桿菌肽的沙門氏菌，觀察到細(xì)胞生存力的下降（4小時(shí)后有活力的細(xì)胞計(jì)數(shù)下降了3個(gè)數(shù)量級(jí)別，而當(dāng)沙門氏菌從培養(yǎng)介質(zhì)中移出后，清洗然后在培養(yǎng)基中重懸，細(xì)胞活力沒有恢復(fù)。

2.2.2 在沙門氏菌上進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，腸桿菌肽能顯著的抑制NADH和琥珀酸脫氫酶的活性改變氧氣的利用速度，而這兩個(gè)酶都是協(xié)助細(xì)胞膜穿膜的酶類。

2.2.3 因?yàn)楹粑δ芤蕾囉谕暾陀泄δ艿募?xì)胞質(zhì)膜，故研究在腸桿菌肽作用下沙門氏菌膜的完整性。試驗(yàn)采用熒光探針DiSC3，其能研究膜電勢的改變從而測定指數(shù)期生長細(xì)胞中敏感性。在對照實(shí)驗(yàn)中，DiSC3的熒光性隨著時(shí)間有個(gè)重要的下降，顯示沙門氏菌在含有葡萄糖的介質(zhì)中孵育，其細(xì)胞膜會(huì)發(fā)生極化。然而，當(dāng)細(xì)胞與腸桿菌肽預(yù)孵化，與對照組相比，熒光下降的更慢一點(diǎn)，其原因是細(xì)胞膜是不完整的，膜電勢的改變敏感度下降。故我們可以確定，腸桿菌肽是通過這兩種方式來抑制和殺滅病原菌，首先通過改變膜通透性使細(xì)胞膜破損，隨后進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部與RNA聚合酶結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而使細(xì)菌破裂死亡。

腸桿菌肽是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的索套結(jié)構(gòu)的多肽分子。而定的意義。腸桿菌肽是一種無溶血性，抗菌活性強(qiáng)，不易產(chǎn)生耐藥的抗菌肽，對于人類及動(dòng)物抵抗病原菌具有重要意義。

3 腸桿菌肽在畜牧上的應(yīng)用

3.1 腸桿菌肽與硫酸粘桿菌素對斷奶仔豬生產(chǎn)性能、腹瀉率和死亡率的影響（見表1）

試驗(yàn)選擇150頭29日齡斷奶杜×長×大三元雜交仔豬，每個(gè)處理 5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭仔豬，試驗(yàn)期30天。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，日糧中添加腸桿菌肽的斷奶仔豬從日增重、料肉比、腹瀉率等指標(biāo)上來看均高于對照組，達(dá)到索套肽是目前抗菌肽領(lǐng)域研究的一大熱點(diǎn)，其抑菌機(jī)制與傳統(tǒng)的抗生素有所不同，不易產(chǎn)生耐藥性，其作為新藥開發(fā)來對抗細(xì)菌感染的潛力巨大。Fabian采用體內(nèi)和體外評(píng)價(jià)腸桿菌肽對沙門氏菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)腸桿菌肽體外經(jīng)過24小時(shí)在全血、血漿以及血清中保持完全活性，且不會(huì)出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。與對照組比較，處理組會(huì)使全血、同源的血漿和血清中沙門氏菌的數(shù)量顯著降低。使用3毫克/鼠劑量的腸桿菌進(jìn)行治療的小鼠的肝臟和脾臟中沙門氏菌活菌數(shù)顯著降低了2～3個(gè)數(shù)量級(jí)，且用24小時(shí)給藥和6天給藥方式的小鼠結(jié)果一致。說明腸桿菌肽能在體外和體內(nèi)殺滅沙門氏菌。Sophie研究發(fā)現(xiàn)腸桿菌肽能抑制腹瀉型大腸桿菌O157，對于治療大腸桿菌引起的腹瀉具有一10%硫酸粘桿菌素的效果，綜合試驗(yàn)結(jié)果說明腸桿菌肽可替代硫酸粘桿菌素，并促進(jìn)斷奶仔豬生長。

表1 腸桿菌肽與硫酸粘桿菌素對斷奶仔豬生產(chǎn)性能、腹瀉率和死亡率的影響

表2 腸桿菌肽與硫酸粘桿菌素對保育豬生產(chǎn)性能的影響

表3 腸桿菌肽與喹乙醇對保育豬生產(chǎn)性能的影響

表4 腸桿菌肽對母豬生產(chǎn)性能的影響

表5 腸桿菌肽對AA肉雞生產(chǎn)性能的影響

3.2 腸桿菌肽與硫酸粘桿菌素對保育豬生產(chǎn)性能的影響（見表2）

108頭30日齡斷奶杜×長×大三元雜交仔豬，每個(gè)處理 6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6頭仔豬，試驗(yàn)期30天。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，日糧中添加腸桿菌肽的保育豬從日增重、料肉比、腹瀉率、死淘率等指標(biāo)來看結(jié)果均優(yōu)于對照組，且個(gè)別指標(biāo)優(yōu)于硫酸粘桿菌素組。綜合試驗(yàn)結(jié)果說明腸桿菌肽可完全替代硫酸粘桿菌素，并促進(jìn)保育豬生長。

3.3 腸桿菌肽與喹乙醇對保育豬生產(chǎn)性能的影響（見表3）

84頭保育仔豬，隨機(jī)分為 3組進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，日糧中添加腸桿菌肽的保育豬，從日增重和料肉比來看，均高于對照組和喹乙醇組。綜合試驗(yàn)結(jié)果表明腸桿菌肽可完全替代喹乙醇，并能促進(jìn)保育豬生長。

3.4 腸桿菌肽對母豬生產(chǎn)性能的影響（見表4）

40頭配種時(shí)間接近、胎次大致相同、體重大致接近、健康狀況良好的長白×大約克經(jīng)產(chǎn)母豬，隨機(jī)分為兩個(gè)處理，每個(gè)處理20頭。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，日糧中添加腸桿菌肽能夠提高仔豬斷奶重和成活率，同時(shí)顯著改善仔豬的腹瀉問題，且對仔豬疾病起到一定的預(yù)防作用。

3.5 腸桿菌肽對AA肉雞生產(chǎn)性能的影響（見表5）

1日齡健康A(chǔ)A+肉雞4800只隨機(jī)分為兩個(gè)處理組，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)400只，試驗(yàn)期42天。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，日糧中添加腸桿菌肽能夠增加肉雞出欄體重和平均日增重、降低死亡率、提高飼料的轉(zhuǎn)化率、提高肉雞的生產(chǎn)成績，改善肉雞的生產(chǎn)性能。

3.6 腸桿菌肽對仔豬黃痢的治療

用法用量：腸桿菌肽5毫克兌20毫升生理鹽水，每頭豬每次灌服3毫升，每天一次，連用3天，仔豬肛門周圍及產(chǎn)床上無黃色稀糞便。