王文強(qiáng)，張琪，譚龍，唐彩云，劉圣美，陳雯，沈鈞，張萬(wàn)起

論著

候選基因單核苷酸多態(tài)性與天津漢族人群甲狀腺功能減退癥相關(guān)性研究

王文強(qiáng)1，張琪1，譚龍1，唐彩云1，劉圣美1，陳雯1，沈鈞2，張萬(wàn)起1

（天津醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院1.營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系；2.衛(wèi)生化學(xué)教研室，天津300070）

目的：探索候選SNP位點(diǎn)與天津漢族人群甲狀腺功能減退癥（甲減）易感性的關(guān)系，尋找影響甲狀腺功能的SNP位點(diǎn)。方法:采用病例對(duì)照研究，在天津地區(qū)共收集336例甲減病例和328例體檢健康的對(duì)照人群，收集靜脈血5 mL，采用Sequenom MassARRAY技術(shù)對(duì)PTC、VAV3、FOXE1、KIT、CCBE1基因及其附近區(qū)域上的8個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。結(jié)果：基于等位基因的性別分層分析顯示，在男性中，僅VAV3基因的位點(diǎn)rs4915077與甲減的易感性顯著相關(guān)，P=0.027。而在女性中，VAV3基因的rs1472565，KIT基因附近的 rs17827152和 CCBE1基因上的 rs4940904位點(diǎn)與甲減的易感關(guān)聯(lián)性極為顯著，P分別為0.001，0.012和0.023。基于基因型性別分層分析顯示，僅在女性中發(fā)現(xiàn)KIT基因的rs17827152與甲減有顯著關(guān)聯(lián)性，P=0.034。多因素Logistic回歸分析顯示，在男性中，rs4915077位點(diǎn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.04），其回歸模型的偏回歸系數(shù)β=-0.544。在女性中，僅rs17827152位點(diǎn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.011），偏回歸系數(shù)β=-0.723。結(jié)論：在天津漢族男性中，VAV3基因的rs4915077位點(diǎn)多態(tài)性與甲減的易感性相關(guān)，而在女性中，VAV3基因的rs1472565，KIT基因的rs17827152和CCBE1基因的rs4940904位點(diǎn)多態(tài)性均與甲減的易感性相關(guān)。

甲狀腺功能減退癥；基因多態(tài)性；單核苷酸；關(guān)聯(lián)分析

原發(fā)性甲狀腺功能減退癥（甲減）是由甲狀腺本身病變引起的甲狀腺疾病，是一種常見(jiàn)的激素缺乏性內(nèi)分泌疾病,患者的下丘腦、垂體無(wú)病變，以血清游離三磺甲狀腺原氨酸（FT3）、游離甲狀腺素（FT4）水平減低，促甲狀腺素（TSH）水平增高為特征，臨床表現(xiàn)多樣，包括有畏寒、體質(zhì)量增加、皮膚干燥、便秘、心動(dòng)過(guò)緩、聲音嘶啞、反應(yīng)遲緩等[1-2]。此類(lèi)疾病可以由很多原因引起，主要原因有甲狀腺不發(fā)育或發(fā)育不全、甲狀腺激素合成酶缺陷、長(zhǎng)期缺碘、甲狀腺手術(shù)、放射性碘131治療、甲狀腺炎、抑制甲狀腺激素生成的藥物以及調(diào)控功能的基因突變等[3-5]。其中，基因突變因素所導(dǎo)致的甲減越來(lái)越受到學(xué)者們的關(guān)注。自從2005年以來(lái)，全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）確立了900多類(lèi)基因變異與200多個(gè)疾病之間的相關(guān)研究[6-9]，其中包括關(guān)于甲減的全基因組關(guān)聯(lián)性研究，Joshua等[10]的GWAS研究發(fā)表于2011年，首次揭示了FOXE1基因附近遺傳區(qū)域與甲減的關(guān)聯(lián)性。由于不同地域、不同環(huán)境下的甲減的患病率和病因差異很大，加之上述GWAS研究均是針對(duì)西方高加索人種進(jìn)行的，發(fā)現(xiàn)的陽(yáng)性突變位點(diǎn)是否適用于天津漢族黃色人種尚不可知。因此，為了解天津漢族人群甲減患者的遺傳病因，本研究對(duì)GWAS報(bào)道出來(lái)的8個(gè)SNP位點(diǎn)在天津漢族人群中進(jìn)行驗(yàn)證，探討這些位點(diǎn)多態(tài)性與天津漢族人群甲狀腺功能減退癥之間的關(guān)聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究所選對(duì)象為2013年2月-2014年2月由天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院確診的336例甲減患者作為病例組，體檢健康的328例人群作為對(duì)照組。

1.2 血液標(biāo)本的收集與儲(chǔ)存 收集病例組和對(duì)照組人群的外周促凝血5 mL，棄血清，收集1～2 g血凝塊于Eppendorf管中，保存在-80℃冰箱。獲得天津醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，被調(diào)查者均對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.3 SNP位點(diǎn)的選擇 根據(jù)閱讀中外相關(guān)文獻(xiàn)，內(nèi)容主要涉及基因與甲狀腺功能減退癥的關(guān)聯(lián)性研究，從國(guó)外已報(bào)道過(guò)的PTC、VAV3、FOXE1、KIT、CCBE1基因中篩選出8個(gè)候選SNP位點(diǎn)，探討其與中國(guó)漢族人群甲狀腺功能減退癥的關(guān)聯(lián)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布資料（年齡、FT3、FT4）采用s表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。非正態(tài)分布資料（TSH）采用中位數(shù)（M）和四分位間距（P25～P75）表示，非正態(tài)分布資料的比較采用秩和檢驗(yàn)。分類(lèi)變量（性別）的兩組率的比較采用χ2檢驗(yàn)，分析時(shí)還使用了多因素Logistic回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 調(diào)查對(duì)象的一般情況 病例組與對(duì)照組人群年齡因素經(jīng)t檢驗(yàn)后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但χ2檢驗(yàn)后性別上有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），后續(xù)將使用性別分層分析排除混雜因素影響。調(diào)查對(duì)象的血清FT3、FT4和TSH水平見(jiàn)表1。

表1 研究對(duì)象的一般特征及甲狀腺激素水平對(duì)比Tab 1 General characteristics and thyroid hormone levels of the subjects

2.2 單個(gè)SNP位點(diǎn)的病例對(duì)照分析

2.2.1 基于單個(gè)SNP位點(diǎn)等位基因的性別分層分析 以性別作為分層因素，將8個(gè)SNP的等位基因與甲減的患病風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果顯示，在男性中，僅位點(diǎn)rs4915077與甲減患病風(fēng)險(xiǎn)之間存在顯著的關(guān)聯(lián)性，P為0.027。在此位點(diǎn)中，等位基因T和C在病例組和對(duì)照組中的分布為61/31和198/ 56，P＜0.05，表明野生等位基因T的存在可能減少患甲減的風(fēng)險(xiǎn)，而突變的等位基因C可增加甲減的易感性，OR為0.56(0.33～0.94)。然而在女性患者中，位點(diǎn)rs1472565，rs17827152和rs4940904與甲減的易感關(guān)聯(lián)性均極為顯著，P分別為 0.001，0.012和0.023。對(duì)于位點(diǎn)rs1472565來(lái)說(shuō)，等位基因T和C在病例組和對(duì)照組中的分布為320/260和156/246，P＜0.05。表明等位基因T的存在增加了女性患甲減的風(fēng)險(xiǎn)，OR為1.94(1.49～2.51）。對(duì)于rs17827152來(lái)說(shuō)，等位基因G和A在病例組和對(duì)照組中的分布為528/52和383/19，P＜0.05。表明野生型等位基因G的存在可減少患甲減的風(fēng)險(xiǎn)，是保護(hù)因素，OR為0.51（0.29～0.87）。在位點(diǎn)rs4940904中，等位基因T和C在病例組和對(duì)照組中的分布為211/369和118/284，P＜0.05。表明突變型等位基因T的存在增加了女性患甲減的風(fēng)險(xiǎn)，OR值1.38（1.05～1.81）（表2）。

2.2.2 基于SNP位點(diǎn)基因型的性別分層分析 每個(gè)SNPs位點(diǎn)均有2～3種基因型，將研究對(duì)象中3種基因型的分布進(jìn)行列聯(lián)表χ2檢驗(yàn)，根據(jù)P值判斷基因型與甲減的易感性之間是否存在關(guān)聯(lián)。結(jié)果顯示，僅在女性中，KIT基因附近的rs17827152位點(diǎn)與甲減的易感性存在顯著關(guān)聯(lián)性，此位點(diǎn)的GG、GA和AA 3種基因型在病例組和對(duì)照組中的分布為239/50/1和182/19/0，P=0.034。表明該位點(diǎn)處的基因型多態(tài)性與女性甲減的易感性密切相關(guān)，而雜合基因型GA和突變基因型AA可能是女性甲減患病率高的危險(xiǎn)因素。而男性的候選位點(diǎn)的基因型均未發(fā)現(xiàn)與甲減癥相關(guān)聯(lián)（表3）。

表2 基于單個(gè)SNP位點(diǎn)等位基因的性別分層分析Tab 2 Gender stratification analysis based on single SNP

表3 基于SNP位點(diǎn)基因型的性別分層分析Tab 3 Gender stratification analysis based on SNP genotypes

2.2.3 基于性別分層的多因素Logistic回歸分析 運(yùn)用非條件多因素Logistic回歸分析的方法，在男性和女性中分析年齡和8個(gè)SNP位點(diǎn)共9個(gè)因素與甲減罹患風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。采用向前逐步分析法，共篩選出兩個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量。在男性中，位點(diǎn)rs4915077的OR為0.581（0.345～0.976），P=0.04，表明野生基因型TT攜帶者患甲減的風(fēng)險(xiǎn)低于突變型TC的人群，偏回歸系數(shù)β為-0.544，野生基因型TT是保護(hù)因素。而在女性中，位點(diǎn)rs17827152的OR為0.485（0.278～0.848），P=0.011，表明野生基因型GG攜帶者患甲減的風(fēng)險(xiǎn)低于突變基因型GA的人群，偏回歸系數(shù)β為-0.723，野生基因型TT也是保護(hù)因素（表4）。

表4 基于性別分層的多因素Logistic回歸分析Tab 4 Themulti-factorLogisticregressionanalysisbasedongender stratification

3 討論

甲狀腺功能減退癥是由于甲狀腺激素合成及分泌減少，或其生理效應(yīng)不足所致機(jī)體代謝降低的一種疾病。近年來(lái)，隨著生活節(jié)奏的加快、飲食結(jié)構(gòu)的改變以及診斷技術(shù)的提高，甲狀腺功能減退癥的檢出率呈上升趨勢(shì)[11]。目前對(duì)于該病因的研究多集中在先天性甲狀腺發(fā)育不全、手術(shù)或藥物、碘的攝入不足或過(guò)量所致、甲狀腺激素合成酶缺陷等幾個(gè)方面，其中對(duì)于此病癥遺傳因素的研究越來(lái)越受到重視。有研究證明，人群血清甲狀腺激素和促甲狀腺激素的個(gè)體間的變異大約有40%～65%歸因于遺傳變異[12]。由此提示我們，對(duì)于甲減遺傳易感因素的研究將有助于該病復(fù)雜病因的深入挖掘和探討，為其病因的研究提供新的思路和線索。隨著GWAS技術(shù)的流行，每個(gè)疾病領(lǐng)域都在做基因組的SNP分析。在不同種族、不同的地域上甲減的患病率存在明顯的差異，這可能是由于不同人群的致病遺傳和環(huán)境因素分布差異造成的，因此，在非高加索人種的天津漢族人群中進(jìn)行該病的遺傳探索勢(shì)在必行。Joshua等[10]的研究從5個(gè)電子病歷數(shù)據(jù)庫(kù)中納入了1 317名甲減患者和5 053名甲狀腺功能正常的對(duì)照為研究對(duì)象，揭示了FOXE1基因附近遺傳區(qū)域與甲減病癥的關(guān)聯(lián)性，并發(fā)現(xiàn)rs7850258位點(diǎn)與甲減的易感性最為顯著[10]，但我們的研究并未驗(yàn)證出此二者間的關(guān)聯(lián)性，F(xiàn)OXE1基因附近的rs7850258位點(diǎn)在東亞人群中的頻率明顯較高加索人種低，而且關(guān)聯(lián)研究本就是基于位點(diǎn)間存在的連鎖不平衡原理而來(lái)，未發(fā)現(xiàn)關(guān)聯(lián)性也說(shuō)明由于該位點(diǎn)在中國(guó)漢族人群中出現(xiàn)的頻率低所致連鎖不平衡現(xiàn)象不顯著。Jyt等[13]以網(wǎng)絡(luò)問(wèn)卷調(diào)查為臨床資料收集方法，研究對(duì)象為3 736名甲減患者和35 546名甲狀腺功能正常對(duì)照，該研究定位了5個(gè)與甲減病癥相關(guān)的遺傳位點(diǎn):PTPN22基因附近的rs6679677、SH2B3-rs3184504、HLA-1-rs2517532，VAV3基因附近的rs4915077、rs1472565和 FOXE1基 因 附 近 的rs925489。其中，位點(diǎn)rs4915077在天津漢族男性人群中得到了驗(yàn)證，VAV3基因上的位點(diǎn)rs1472565在女性人群中得到驗(yàn)證，此二者與甲減的易感性存在顯著性的相關(guān)。遺憾的是rs925489并未在此研究中得到證實(shí)，這可能也是由于其基因頻率在中國(guó)漢族人群和高加索人種之間存在差異所致。候選基因關(guān)聯(lián)研究也發(fā)現(xiàn)PTPN22基因、HLA基因、CTLA4基因和8q23-24區(qū)域與自身免疫性甲狀腺功能減退的關(guān)聯(lián)性。此外，國(guó)外學(xué)者關(guān)于與血清TSH水平相關(guān)的GWAS也定位了多個(gè)遺傳位點(diǎn)，包括PDE8B基因、FOXE1基因、PDE8B基因、CAPZB基因、CCBE1基因和NKX2-1基因以及4p12-KIT基因附近遺傳區(qū)域[14-16]，而且此次KIT附近的rs17827152位點(diǎn)和CCBE1基因上rs4940904位點(diǎn)在天津漢族女性人群中與甲減的關(guān)聯(lián)性得以證實(shí)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，在天津男性人群中，VAV3基因附近的位點(diǎn)rs4915077多態(tài)性與甲減的易感性顯著相關(guān)，可能是男性易患甲減的危險(xiǎn)因素。而在天津女性人群中，我們驗(yàn)證出VAV3基因上rs1472565、KIT附近基因上rs17827152和CCBE1基因上rs4940904位點(diǎn)的多態(tài)性與甲減的易感性顯著相關(guān)聯(lián)，可能擁有此基因位點(diǎn)的女性更易感甲減。

[1] Connor S E,Penney C C.MRI in the differential diagnosis of a sellar mass[J].Clin Radiol,2003,58（1）:20

[2]張文禮，馬建華.66例甲狀腺功能減退癥患者的特殊臨床表現(xiàn)及誤診漏診分析[J].重慶醫(yī)學(xué)，2010，24（24）:3380

[3] Almandoz J P,Gharib H.Hypothyroidism:etiology,diagnosis,and management[J].Med Clin North Am，2012，96（2）:203

[4] Burch H B,Burman K D,Cooper D S.A 2013 survey of clinical practice patterns in the management of primary hypothyroidism[J].J Clin Endocrinol Metab，2014，99（6）:2077

[5] 翟彪，郭海.原發(fā)性甲狀腺功能減退癥的病因分析[J].中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2009，3（8）:85

[6] Hindorff L A,Sethupathy P,Junkins H A,et al.Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits[J].ProcNatlAcadSciUSA,2009,106（23）:9362

[7] Malinowski J R,Denny J C,Bielinski S J,et al.Genetic variants associated with serum thyroid stimulating hormone(TSH)levels in European americans and African americans from the eMERGE network[J].PLoS One,2014,9（12）:e111301

[8]Mccarty C A,Chisholm R L,Chute C G,et al.The eMERGE network: a consortium of biorepositories linked to electronic medical records data for conducting genomic studies[J].BMC Med Genomics,2011, 4（1）:13

[9] Pathak J,Kiefer R C,Bielinski S J.Applying semantic web technologies for phenome-wide scan using an electronic health record linked Biobank[J].J Biomed Semantics,2012,3（1）:10

[10]Joshua C.Variants near FOXE1 are associated with hypothyroidism and other thyroid conditions:using Electronic Medical Records for Genome-andPhenome-widestudies[J].ClinGenet,2011,63（6）:529 [11]Korzeniewski S J,Kleyn M,Young W I,et al.Screening for congenital hypothyroidism in newborns transferred to neonatal intensive care[J]. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed,2013,98（4）:F310

[12]Frost M,Petersen I,Hegedüs L,et al.Regulation of the Pituitary-Thyroid axis in adulthood is not related to birth weight:evidence from extremely birth weight discordant monozygotic Danish twin pairs[J].Thyroid,2013,23（7）:785

[13]Jyt N E,Kiefer A K,David A H,et al.Novel associations for hypothyroidism include KnownAutoimmune risk loci[J].PLoS One, 2012,23（7）:785

[14]Criswell L A,Pfeiffer K A,Lum R F,et al.Analysis of families in the multipleautoimmunediseasegeneticsconsortium（MADGC）collection: the PTPN22 620W allele associates with multiple autoimmune phenotypes[J].Am J Hum Genet,2005,76（4）:561

[15]Simmonds M J,Gough S C L.The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease:the never ending story[J].Brief Funct Genomics,2011,10（2）:77

[16]Tomer Y.Genetic susceptibility to autoimmune thyroid disease:past, present,and future[J].Thyroid,2010,20（7）:715

（2015-11-05收稿）

Association between single nucleotide polymorphism loci of candidate gene and hypothyroidism in Tianjin Han population

WANG Wen-qiang1,ZHANG Qi1,TAN Long1,TANG Cai-yun1,LIU Sheng-mei1,CHEN Wen1,SHEN Jun2,ZHANG Wan-qi1
（1.Department of Nutrition and Food Hygiene；2.Department of Health and Chemistry,School of Public Health,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China）

Objective：To explore the relationship between the candidate single nucleotide polymorphism (SNPs)regulating thyroid function and the hypothyroidism(HT)susceptibility of Tianjin Han population,and to search the SNP loci which affecting the thyroid function.Methods：A case-control study was used and a total of 336 HT patients and 328 normal individuals were interviewed with 5 mL venous blood in Tianjin.The 8 SNP loci located in PTC,VAV3,FOXE1,KIT,CCBE1 genes were genotyped with Sequenom MassARRAY Technology.Results：Results of the alleles of gender stratification analysis showed that only rs4915077 in VAV3 gene was associated with HT,P=0.027 in male.However，among female the rs1472565 in VAV3 gene,rs17827152 in KIT gene and rs4940904 in CCBE1 were associated with HT susceptibility,and P values were 0.001,0.012 and 0.023,respectively.Results of the genotypes of gender stratification analysis showed that only rs17827152 in KIT gene was associated with HT susceptibility,and P value was 0.034 in female.The logistic regression analysis showed that rs4915077 in VAV3 gene was statistically significant(P=0.04),and the partial regression coefficient was -0.544 in male population.In female,only rs17827152 in KIT gene was statistically significant(P=0.011),and the partial regression coefficient was-0.723.Conclusion：Rs4915077 in VAV3 gene is associated with HT susceptibility in Tianjin Han male and rs1472565 in VAV3 gene,rs17827152 in KIT gene and rs4940904 in CCBE1 are associated with HT susceptibility in female population.

hypothyroidism;polymorphism;single nucleotide;association analysis

R581.2

A

1006－8147（2016）02-0111-04

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (81330064，81273057)，天津市科委科技支撐項(xiàng)目(14ZCZDSY00022)

王文強(qiáng)（1987-），男，碩士在讀，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)；通信作者：張萬(wàn)起，E-mail：wqzhang126@126.com。