李寧，馬駿

（天津醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)系，天津300070）

論著

長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOTAIR在膀胱癌中的表達(dá)及臨床意義

李寧，馬駿

（天津醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)系，天津300070）

目的：探討長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOTAIR在膀胱癌組織與癌旁正常組織的表達(dá)差異，了解HOTAIR與膀胱癌惡性程度、進(jìn)展及預(yù)后的相關(guān)性。方法：采用qRT-PCR方法檢測(cè)88例膀胱癌組織與癌旁正常組織中HOTAIR RNA的差異表達(dá)，分析HOTAIR表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系，采用Kapaln-Meier生存分析及COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析HOTAIR表達(dá)水平與膀胱患者預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果：膀胱癌組織中HOTAIR RNA表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，HOTAIR RNA高表達(dá)與腫瘤高分級(jí)及臨床高分期有關(guān)（P＜0.05），HOTAIR高表達(dá)組膀胱癌患者5年生存率明顯低于HOTAIR低表達(dá)組（P＜0.05），COX回歸分析提示HOTAIR RNA高表達(dá)可能為膀胱癌不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因子之一。結(jié)論：長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOTAIR與膀胱癌發(fā)生發(fā)展及其惡性程度相關(guān)，HOTAIR可以作為預(yù)測(cè)膀胱癌患者生存率的分子標(biāo)志物。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA;HOTAIR;膀胱癌

膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，據(jù)美國(guó)國(guó)家癌癥研究所統(tǒng)計(jì)，2014年美國(guó)有74 690例新發(fā)膀胱癌病例，其中男性56 390例，女性18 300例，并有15 580例患者死于膀胱癌[1]。我國(guó)膀胱癌發(fā)病率低于歐美國(guó)家，但近10年來(lái)其發(fā)病率逐年增加[2]。75%的新發(fā)膀胱癌為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌具有較高的復(fù)發(fā)率，并有一部分發(fā)展為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌[3-4]，這使得膀胱癌成為治療花費(fèi)最多的惡性腫瘤之一[5]。肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者的預(yù)后較差，約有50%的肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者在診斷后3年發(fā)生轉(zhuǎn)移和死亡[6]。目前膀胱癌的治療選擇和預(yù)后判斷主要依賴臨床分期和病理分級(jí)，然而具有同樣臨床和病理特點(diǎn)的病人，預(yù)后卻存在著極大的不同，因此迫切需要尋找到有助于膀胱癌早期診斷和預(yù)后判斷的新的生物指標(biāo)[7]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA,lncRNA）在正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控中起著重要作用，并且lncRNA的異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān)；lncRNA可以作為腫瘤預(yù)后的判斷指標(biāo)及新的治療靶點(diǎn)[8]。HOTAIR是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的具備反式調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄作用的lncRNA，近年來(lái)的研究證明HOTAIR在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，其表達(dá)量與腫瘤的轉(zhuǎn)移、進(jìn)展及預(yù)后有著重要聯(lián)系[9]。而目前膀胱癌中HOTAIR的研究相對(duì)較少，我們擬通過(guò)檢測(cè)膀胱癌組織HOTAIR的表達(dá)情況，分析其與膀胱癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，明確其對(duì)膀胱癌預(yù)后的指示作用。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本 本研究88例組織標(biāo)本來(lái)源于天津某醫(yī)院2006-2008年經(jīng)全膀胱手術(shù)切除的膀胱癌組織及癌旁正常組織，其中男性患者77例，女性患者11例，患者術(shù)前未行放療、化療，所有標(biāo)本在手術(shù)切除離體后立即置入液氮冷凍，后轉(zhuǎn)入-80℃條件下低溫保存，取距離腫瘤邊緣3cm以上的正常膀胱黏膜作為對(duì)照組，所有組織標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查確認(rèn)?；颊呔押炇鹬橥鈺?shū)，并經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 PCR引物（北京六合華大基因科技有限公司），TRIZOL試劑（AppliedInvitrogen,Carlsbad, CA，USA），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT-PCR kit; Takara Bio），F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master（Roche）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 按照說(shuō)明書(shū)要求，使用TRIZOL提取膀胱癌組織及癌旁正常組織中的總RNA，1 μg總RNA在20 μL體系中應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將cDNA凍存于-80℃冰箱備用。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)膀胱癌組織及癌旁組織中HOTAIR RNA的表達(dá) HOTAIR上游引物: 5′-CAGTGGGGAACTCTGACTCG-3′，下游引物:5′-GTGCCTGGTGCTCTCTTACC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度94 bp。GAPDH上游引物:5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物:5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度226 bp。按實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)，以20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，陰性對(duì)照用1 μL DEPC處理的超純水代替cDNA模板。反應(yīng)條件:95℃10min；95℃15 s；60℃1 min；45個(gè)循環(huán)反應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果用2T-△△C法進(jìn)行分析，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)管理和統(tǒng)計(jì)分析，癌組織及癌旁組織中HOTAIR的表達(dá)量以s表示，組間表達(dá)差異分析采用t檢驗(yàn)；定性資料采用χ2檢驗(yàn)；應(yīng)用Kaplan-Meier生存分析和Log-Rank檢驗(yàn)分析HOTAIR表達(dá)量與膀胱癌患者預(yù)后關(guān)系；采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析膀胱癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌組織與癌旁正常組織中HOTAIR RNA的表達(dá)情況 RT-PCR結(jié)果顯示，HOTAIR RNA在88例膀胱癌組織中的表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（4.026±0.290 vs 1.424±0.106，P＜0.05，圖1）。

圖1 膀胱癌組織及癌旁正常組織中HOTAIR RNA的相對(duì)表達(dá)量Fig 1 RelativelevelofHOTAIRinbladdercancertissuesandadjacent non-cancer tissues

2.2 膀胱癌組織中HOTAIR RNA表達(dá)量與臨床病理關(guān)系 根據(jù)膀胱癌組織中的HOTAIR RNA的平均表達(dá)量確定膀胱癌組織中HOTAIR RNA的高低表達(dá)情況。采用χ2檢驗(yàn)分析HOTAIR RNA表達(dá)情況與膀胱癌臨床病理指標(biāo)相關(guān)性。高表達(dá)的HOTAIR RNA與病理分期（P＜0.001）、分級(jí)密切相關(guān)（P=0.001），與患者年齡、性別、吸煙史、腫瘤大小沒(méi)有相關(guān)性（表1）。

表1 癌組織中HOTAIR表達(dá)量與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab 1 Association between HOTAIR expression and various clinicopath ological factors of bladder cancer patients

2.3 HOTAIR RNA表達(dá)量對(duì)膀胱癌患者生存時(shí)間的影響 采用Kaplan-Meier生存曲線分析膀胱癌組織中HOTAIR RNA表達(dá)情況對(duì)膀胱癌患者5年生存率的影響，HOTAIR RNA高表達(dá)組膀胱癌患者5年生存率低于HOTAIR RNA低表達(dá)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，Log-Rank檢驗(yàn)，圖2）。進(jìn)一步通過(guò)COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析模型分析了與膀胱癌患者預(yù)后相關(guān)的影響因素:單因素分析顯示，病理分期，HOTAIR的表達(dá)水平為影響膀胱癌患者5年生存率的危險(xiǎn)因素；多因素分析顯示，膀胱癌組織中HOTAIR的表達(dá)水平，可以作為膀胱癌患者5年生存率的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子（表2）。

圖2 膀胱癌不同HOTAIR表達(dá)組患者生存率Fig 2 The overall survival rate of patients estimated according to the HOTAIR expression level in bladder cancer patients

表2 COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析患者生存影響因素Tab 2 Univariate and multivariate analysis of prognostic factors with respect to 5-year overall survival of patients with bladder cancer

3 討論

基因表達(dá)的異常調(diào)控在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到了重要作用。一般情況下，人類常染色體中幾乎所有核苷酸都有轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象[10]。隨著基因組測(cè)序計(jì)劃的完成以及新一代深度測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用，人們發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物中多于95%的轉(zhuǎn)錄序列為非編碼RNA[11]。lncRNA是長(zhǎng)度大于200 bp的非編碼RNA分子，與micoRNA不同，lncRNA研究尚處于起步階段。越來(lái)越多的研究開(kāi)始將lncRNA與疾病聯(lián)系起來(lái)，其表達(dá)異常能夠引起一系列疾病包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展。HOTAIR是lncRNAs的成員之一，轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度為2.2 kb，定位在人類染色體12q13.13上的HOXC家族的HOXC11基因和HOX12基因之間[12]。在乳腺癌中研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR在乳腺癌原發(fā)病灶及轉(zhuǎn)移性病灶中高表達(dá)，與乳腺癌的進(jìn)展轉(zhuǎn)移存在重要關(guān)系，為預(yù)測(cè)乳腺癌患者生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[9]。在肝癌、胃腸道間質(zhì)瘤以及胰腺癌中亦發(fā)現(xiàn)了HOTAIR的表達(dá)明顯升高，HOTAIR表達(dá)水平與患者生存期呈負(fù)相關(guān)[13-15]。

本研究通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)HOTAIR在膀胱癌組織及癌旁正常組織中的差異表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，膀胱癌組織中HOTAIR的表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織；結(jié)合臨床病理相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織中HOTAIR的表達(dá)量與膀胱癌高分期、分級(jí)密切相關(guān)，而與患者年齡，性別，吸煙史，腫瘤大小沒(méi)有相關(guān)性。據(jù)此我們推測(cè)HOTAIR可能與膀胱癌的發(fā)生進(jìn)展存在相關(guān)性。為了證實(shí)這一推測(cè)，筆者采用Kaplan-Merier生存分析方法檢驗(yàn)了不同HOTAIR表達(dá)組膀胱癌患者5年生存率的差異，HOTAIR高表達(dá)組膀胱癌患者5年生存率明顯低于HOTAIR低表達(dá)組，差異具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步的COX回歸分析證實(shí)，高表達(dá)的HOTAIR為膀胱癌不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因子之一。本研究也檢測(cè)了Ta/T1期膀胱癌患者中HOTAIR的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)HOTAIR高表達(dá)為膀胱癌復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)因素之一[16]。筆者納入的研究標(biāo)本皆取自全膀胱切除患者組織標(biāo)本，其中Ta/T1期患者34例，T2-T4期患者54例，通過(guò)分析不同HOTAIR表達(dá)組患者5年生存率的差異，進(jìn)一步證實(shí)了HOTAIR對(duì)膀胱癌預(yù)后的提示作用。據(jù)此推測(cè)HOTAIR與膀胱癌的發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān)，但其調(diào)控膀胱癌發(fā)生進(jìn)展的具體機(jī)制尚不明確，我們將進(jìn)一步通過(guò)體外體內(nèi)試驗(yàn)，分析HOTAIR調(diào)控膀胱癌進(jìn)展的具體機(jī)制。

膀胱癌臨床病理分期分級(jí)對(duì)膀胱癌的治療選擇及預(yù)后判斷具有重要的提示作用，然而它們對(duì)于膀胱癌患者預(yù)后的提示、治療方式的選擇同時(shí)存在一定的局限性，尤其是對(duì)于行膀胱癌電切的患者，存在病理分期分級(jí)偏低的可能，而且具有同樣病理分期分級(jí)的患者，預(yù)后也大不相同[17]。筆者將進(jìn)一步擴(kuò)大研究的樣本量，在更多的樣本中去驗(yàn)證HOTAIR表達(dá)量對(duì)膀胱癌患者預(yù)后的提示作用，為膀胱癌的個(gè)體化治療提供參考。

綜上所述，我們的研究證實(shí)HOTAIR在膀胱癌組織中高表達(dá)，高表達(dá)的HOTAIR與膀胱癌病理分期、分級(jí)密切相關(guān)，可以作為膀胱癌惡性程度判斷的輔助指標(biāo)，高表達(dá)的HOTAIR可以作為膀胱癌預(yù)后監(jiān)測(cè)重要分子標(biāo)志物。

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（2015－09－16修稿）

Clinical significance of HOTAIR expression in patients with bladder cancer

LI Ning,MA Jun
（Department of Epidemiology and Health Statistics,School of Public Health,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China）

Objective：To investigate the HOTAIR expression in bladder cancer tissues and adjacent non-cancerous tissues and its potential relevance to clinicopathological variables and prognosis.Methods：HOTAIR RNA expression was determined by real-time quantitative polymerase chain reaction in 88 pairs of bladder cancer tissues and adjacent non-cancerous tissues.Kapaln-Meier analysis and COX proportional hazards regression models were used to investigate the correlation between HOTAIR expression and prognosis of bladder cancer patients.Results：This study showed that the expression level of HOTAIR in bladder cancer tissues was significantly higher than those in non-cancerous tissues.The results indicated that high expression of HOTAIR in bladder cancer was associated with advanced stage and high grade（P＜0.05）.Kapaln-Meier survival analysis suggested that patients with high HOTAIR expression was associated with poor overall survival（P＜0.05）.Multivariate analysis revealed that HOTAIR expression was an independent predictor of overall survival. Conclusions：HOTAIR might play a positive role in bladder cancer development and could serve as an biomarker for overall survival of bladder cancer.

long non-coding RNA;HOTAIR;bladder cancer

R737.14

A

1006-8147（2016）02-0126-03

李寧（1984-），女，碩士在讀，研究方向：流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)；通信作者：馬駿，E-mail：majun@tmu.edu.cn。