賀輝+陳燕紅+蘇國強(qiáng)

【摘要】 目的 觀察應(yīng)用RNAi技術(shù)下調(diào)局部粘著斑激酶（FAK） 基因表達(dá)對SW620細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力的影響。方法 利用前期構(gòu)建的針對FAK基因有效的短發(fā)夾RNA （shRNA ）序列的慢病毒表達(dá)載體， 包裝慢病毒并感染人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620。運(yùn)用免疫印記（Western-blot）從蛋白水平檢測FAK基因的表達(dá)， Transwell小室模型分別檢測敲減FAK基因表達(dá)對SW620細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果 用慢病毒敲減FAK后的大腸癌細(xì)胞， 蛋白水平FAK表達(dá)明顯下調(diào)， SW60細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力均受到明顯抑制。結(jié)論 下調(diào)FAK的表達(dá)水平， 能明顯抑制大腸癌SW620細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力。

【關(guān)鍵詞】 慢病毒；局部粘著斑激酶；SW620；人結(jié)腸癌細(xì)胞；短發(fā)夾RNA

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.14.212

Influence by RNAi down-regulated FAK gene on invasion and metastasis ability in colorectal cancer cell SW620 MAO He-hui， CHEN Yan-hong， SU Guo-qiang. Department of Surgery， Xiamen City Maternal and Child Health Care Hospital， Xiamen 361003， China

【Abstract】 Objective To observe influence by RNAi down-regulated focal adhesion leinase （FAK） gene on invasion and metastasis ability in colorectal cancer cell SW620. Methods Lentivirus packaging was made by expression vector of short hairpin RNA （shRNA） sequence established for FAK gene， and human colon cancer cell SW620 was infected. Western-blot was applied to detect FAK gene expression from protein level， and Transwell cell model was used to detected influence by FAK gene knock-down expression on invasion and metastasis ability in SW620. Results In colorectal cancer cell after FAK gene knock-down by lentivirus， protein FAK expression was reduced， while invasion and metastasis ability in SW620 were obviously suppressed. Conclusion Invasion and metastasis ability in colorectal cancer cell SW620 can be remarkably suppressed by down-regulated FAK expression.

【Key words】 Lentivirus； Focal adhesion leinase； SW620； Human colon cancer cell； Short hairpin RNA

大腸癌主要以手術(shù)和化療治療， 但是對復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者， 傳統(tǒng)治療療效較差， 近年來， 靶向治療成為研究熱點(diǎn)。FAK作為細(xì)胞傳導(dǎo)中的重要信號分子， 參與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移， 如果可以抑制FAK基因的表達(dá)， 理論上能降低腫瘤的增殖活性、侵襲及轉(zhuǎn)移能力。既往研究提示， 抑制細(xì)胞內(nèi)FAK基因表達(dá)， 可明顯降低乳腺腫瘤及卵巢腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力 [1， 2]。前期試驗(yàn)中成功構(gòu)建了FAK shRNA重組慢病毒質(zhì)粒， 并制備相應(yīng)的慢病毒感染人大腸癌細(xì)胞SW620[3]， 下調(diào)其FAK基因表達(dá)， 觀察對大腸癌細(xì)胞SW620侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響， 為動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 人大腸癌細(xì)胞株SW620由廈門大學(xué)李博安教授惠贈；Tranwell小室購自Millipore公司；Trizol、Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；RNase-free購自大連寶生公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清等購自Hyclone公司；細(xì)胞培養(yǎng)板及計數(shù)板均購自Costar公司。

1. 2 方法

1. 2. 1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染W(wǎng)estern blot法檢測FAK蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分為1組感染表達(dá)FAK-shRNA（實(shí)驗(yàn)組）， 2組感染無關(guān)序列shRNA， 3組正常SW620細(xì)胞。病毒感染后2 d的細(xì)胞中提取各組等量蛋白， 將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜， 使用已制備的封閉液室溫封閉1 h。用一抗在4℃下與PVDF膜孵育過夜。TBST洗膜3次， 加入與一抗相對應(yīng)的二抗， 在搖床上室溫孵育1 h。TBST洗膜3次， 然后顯色、攝影。

1. 2. 2 細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn) Transwell小室制備：①包被基底膜：用50 mg/L Matrigel稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面， 4℃風(fēng)干。②水化基底膜：吸出培養(yǎng)板中殘余液體， 加入50 μl/孔含10 g/L BSA的無血清培養(yǎng)液， 37℃， 30 min。制備細(xì)胞懸液：消化細(xì)胞， 終止消化后離心棄去培養(yǎng)液， PBS洗

2次， 用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸， 調(diào)整細(xì)胞密度至5×104個/ml。接種細(xì)胞：①取細(xì)胞懸液1 ml加入Transwell小室。②6孔板下室加入2 ml含10%FBS的培養(yǎng)基。③37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。穿膜細(xì)胞計數(shù)：取出Transwell小室， 用棉簽擦去Matrige膠和上室內(nèi)的細(xì)胞， 0.1%結(jié)晶紫染色1 h， 雙蒸水沖洗Transwell小室膜， 然后將其解下， 反面貼于載玻片上， 倒置顯微鏡下計數(shù)， 100倍下取5個視野， 計數(shù)后取平均值。

1. 3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS14.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 SW620細(xì)胞FAK蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染FAK shRNA重組慢病毒）與感染陰性對照組和正常SW620細(xì)胞進(jìn)行比較， 其FAK蛋白表達(dá)水平明顯降低。見圖1。

1. 實(shí)驗(yàn)組；2. 感染陰性對照組；3. 正常SW620細(xì)胞。

圖1 Western blot法檢測FAK蛋白表達(dá)

2. 2 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)（63.9±8.6）明顯少于陰性對照組（98.4±11.9）（P<0.05）， 陰性對照組（98.4±11.9）與未處理組（105.4±14.1）比較， 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.181>0.05）。見圖2。

圖2 敲減FAK基因表達(dá)抑制SW620細(xì)胞的侵襲能力

3 討論

腫瘤發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移是一個多基因參與的復(fù)雜的多步驟過程。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中， 腫瘤細(xì)胞通過表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶和乙酰肝素酶降解基底膜[4]， 這需要通過復(fù)雜的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)。

RNAi是一種基因沉默技術(shù)， 目前廣泛應(yīng)用于腫瘤研究領(lǐng)域， 其作用機(jī)制：核酸內(nèi)切酶（Dicer）將DsRNA切割成多個具有特定長度和結(jié)構(gòu)的小片段RNA（大約21～23 bp）， 即siRNA， 然后siRNA在細(xì)胞內(nèi)RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈， 反義siRNA再與體內(nèi)一些酶（包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等）結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex， RISC）。由RISC介導(dǎo)切割靶mRNA分子中與siRNA反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域， 從而達(dá)到干擾基因表達(dá)作用。

FAK通過調(diào)控細(xì)胞周期來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[5]。有研究顯示， 主要有3條信號傳導(dǎo)通路共同作用于FAK， 然后再通過一系列信號傳導(dǎo)， 誘導(dǎo)周期素D1和周期蛋白依賴性蛋白激酶高表達(dá)， 由此加快細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期， 促進(jìn)細(xì)胞增殖 [6]， 這三條通路包括：①FAK-Ras-MAPK；②FAK-P130cas-Crk-JNK-C-Jun；③FAK-PI3K-AKT通路。Lin [7]研究發(fā)現(xiàn)沉默F(xiàn)AK基因， 抑制FAK-P130cas-Crk-JNK-C-Jun信號通路， 使正常鼠的成纖維細(xì)胞NIH3T3停滯在G1， 無法進(jìn)入S期， 明顯影響該成纖維細(xì)胞的生長。Sonoda等[8]下調(diào)黑色素瘤細(xì)胞FAK基因表達(dá)， 抑制FAK-PI3K-AKT信號通路， 降低細(xì)胞周期蛋白D1和周期蛋白依賴性蛋白激酶4表達(dá)， 明顯抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖。FAK在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中扮演著重要角色。其是細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路中的上游因子， 主要通過以下3條信號傳導(dǎo)通路促進(jìn)細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移[9]：①FAK/Src信號傳導(dǎo)通路。②FAK/PI3K信號通路。③FAK/Rho信號傳導(dǎo)通路。Hauck 等[10]研究表明沉默F(xiàn)AK基因， 可抑制上述3條信號傳導(dǎo)通路， 發(fā)現(xiàn)其研究的腫瘤細(xì)胞侵襲能力明顯下降。Su 等[11]應(yīng)用RNA干擾技術(shù)， 沉默胃癌SGC7901細(xì)胞FAK基因， 抑制胃癌細(xì)胞SGC7901增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移， 同時可以抑制動物體內(nèi)胃癌生長， 減低遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。Egawa等[12]下調(diào)FAK表達(dá)水平， 成功抑制膀胱癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移等能力。本項(xiàng)研究的結(jié)果也表明下調(diào)FAK基因的表達(dá)水平， 大腸癌細(xì)胞SW620侵襲及轉(zhuǎn)移能力明顯下降， 這將為今后大腸癌的靶向治療提供新的靶點(diǎn)。

總之， 利用前期構(gòu)建的pLentilox3.7-shFAK， 制備相應(yīng)的病毒， 感染大腸癌細(xì)胞SW620， 能明顯下調(diào)其FAK的表達(dá)， 從而有效抑制SW620的侵襲及轉(zhuǎn)移能力， 為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。

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[收稿日期：2016-02-01]