陳國梁，田瑞康，　馬靖峰，　楊成成，安　鵬（1.延安大學生命科學學院，陜西延安716000；2.陜西省紅棗重點實驗室，陜西延安716000）

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轉(zhuǎn)基因馬鈴薯淀粉合成酶活性及淀粉質(zhì)量分數(shù)的變化

陳國梁1，2，田瑞康1，2，馬靖峰1，2，楊成成1，2，安鵬1，2
（1.延安大學生命科學學院，陜西延安716000；2.陜西省紅棗重點實驗室，陜西延安716000）

摘要：以轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖為材料，采用雙波長分光光度法、蒽酮比色法測定了其直鏈淀粉、支鏈淀粉和總淀粉的質(zhì)量分數(shù)。對其GBSS、SSS的活性進行了測定，采用SPSS軟件進行了獨立樣本t檢驗。結(jié)果表明：與對照組相比，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯（K5）總淀粉、支鏈淀粉的質(zhì)量分數(shù)升高差異顯著，GBSS、SSS的活性及直鏈淀粉質(zhì)量分數(shù)降低差異顯著。表明利用RNAi對馬鈴薯塊莖淀粉合成酶基因的干擾取得了一定的效果。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因馬鈴薯；淀粉質(zhì)量分數(shù)；直鏈淀粉；支鏈淀粉；淀粉合成酶

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）淀粉是重要的食品和工業(yè)原輔料，是一種廉價易得的可再生性資源，已成為許多生產(chǎn)領(lǐng)域的重要原料。在很多應用領(lǐng)域中，都要求淀粉具有較低的糊化溫度和抗老化能力，高純度的支鏈淀粉就具有這樣的特性[1-3]。而糊化溫度除受所處環(huán)境中的水分、溫度、pH、鹽類、糖類和極性高分子化合物的影響外，主要與直鏈淀粉與支鏈淀粉比例、淀粉鏈長以及淀粉的結(jié)構(gòu)有關(guān)[4-7]。因此，人們?yōu)榱诉M一步拓展馬鈴薯的生產(chǎn)及其淀粉的應用空間，期望培育出具有直鏈淀粉質(zhì)量分數(shù)低，甚至無直鏈淀粉且支鏈淀粉鏈較短的糊化溫度低和優(yōu)良凝沉特性的馬鈴薯新品系。目前，國內(nèi)外研究人員已開始采用基因工程等技術(shù)對淀粉合成過程中相關(guān)酶的活性調(diào)控，以便降低粉中直連淀粉的質(zhì)量分數(shù)，提高支鏈淀粉的質(zhì)量分數(shù)、分枝度和控制支鏈長度等一系列研究[8-13]。本課題組采用RNAi技術(shù)對馬鈴薯塊莖內(nèi)源gbss、ssⅢ和ssⅡ基因進行同時干擾，獲得了相應的轉(zhuǎn)基因試管苗K5[14]，并對其塊莖中直鏈淀粉、支鏈淀粉及總淀粉質(zhì)量分數(shù)的測定，以檢驗干擾效果，為進一步培育優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品種奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實驗材料

轉(zhuǎn)基因馬鈴薯（K5）試管苗與對照組試管苗：由作者所在課題組提供；直鏈淀粉和支鏈淀粉標準品：均為美國Sigma公司產(chǎn)品。

1.2實驗方法

1.2.1轉(zhuǎn)基因微型薯的獲得將轉(zhuǎn)基因馬鈴薯（K5）試管苗及對照接種在MS固體培養(yǎng)基中，置于25℃、1 500～2 000 Lx光照下培養(yǎng)約30 d左右，再轉(zhuǎn)入暗培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng)50～60 d，收獲微型薯。

1.2.2樣品預處理挑取大小一致的轉(zhuǎn)基因微型薯及其對照個體各15顆，分別將其切片后，液氮速凍研磨，取部分凍干粉用于酶活性測定，其余真空冷凍干燥至恒質(zhì)量（36～48 h），過100目篩，采用常虹等的方法[15]依次脫脂、脫糖各3次，烘干，用于淀粉質(zhì)量分數(shù)的測定。

1.2.3淀粉合成酶活性測定參照程方民等[16]的方法，取上述速凍研磨粉1.0 g，加4.0 mL提取液（pH 7.5，100 mmol/L Tricine -NaOH；8 mmol/L MgCl2，2 mmol/L EDTA，12.5%甘油；1% PVP-40，40 mmol/L 的2-巰基乙醇），冰浴研磨成漿，15 000 r/min、4℃離心20 min，收集上清液用于可溶性淀粉合成酶（GBSS）、顆粒結(jié)合淀粉合成酶（SSS）活性的測定，并以煮沸的酶液作對照，以每分鐘利用l μmol ADPG作為1個酶活性單位（U），重復測定3次。

1.2.4總淀粉質(zhì)量分數(shù)的測定參照郭東生等[17]報道的蒽酮比色測定淀粉的方法，以蒽酮-硫酸溶液作空白對照，以O(shè)D值為縱坐標，淀粉質(zhì)量質(zhì)量濃度為橫坐標作圖，制作淀粉含量標準曲線。稱取0.300g上述待測粗樣品于50mL離心管中，加入7 mL 52%高氯酸溶液，攪拌10 min，2 500 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)入20 mL帶蓋試管中，殘留物再用7 mL 52%高氯酸溶液提取，合并提取液，定容，過濾，吸取2 mL濾液于50 mL容量瓶定容，再取2 mL溶液于50 mL容量瓶定容，然后取2 mL沸水浴顯色后測定OD625 nm值，每個樣品做5個重復，依據(jù)OD625 nm平均值，計算馬鈴薯總淀粉質(zhì)量分數(shù)。

1.2.5直鏈淀粉和支鏈淀粉質(zhì)量分數(shù)的測定

1）直鏈淀粉和支鏈淀粉檢測波長的確定及回歸方程的建立：參照黃惠芳等[18-20]的等吸收點作圖法，取直鏈淀粉和支鏈淀粉標準液1 mL，放入50 mL容量瓶中，加蒸餾水25 mL，以0.1 mol/L溶液調(diào)至pH 3.5左右，加碘試劑0.5 mL，并用蒸餾水定容。靜置20 min，以碘為對照，于400-800 nm波段掃描，得到光吸收譜圖。采用繪圖法確定直鏈淀粉測定波長λ1和參比波長λ2支鏈淀粉測定波長λ3和參比波長λ4。

分別移取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL直鏈淀粉標準工作液于50 mL容量瓶中，加25 mL蒸餾水，以0.1 mol/L HCl調(diào)pH至3.5左右[15]，加0.5 mL碘試劑（2% KI、0.2% I2），并用蒸餾水定容。靜置20 min，用I2-KI作對照，在λ1和λ2處分別測定吸光值A(chǔ)，以ΔA為自變量，以相應直鏈淀粉質(zhì)量分數(shù)為變量，建立直鏈淀粉的一元線性回歸方程。分別移取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5 mL支鏈淀粉標準工作液于50 mL容量瓶中，按照上述方法在λ3和λ4處分別測定吸光值A(chǔ)，建立支鏈淀粉的一元線性回歸方程。

2）直鏈、支鏈淀粉質(zhì)量分數(shù)的測定：準確稱取25.0 mg待測樣品，加入1.0 mol/L的NaOH溶液2.5 mL，在75～80℃水浴中分散溶解，用0.1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH至3.5，并定容至50 mL，吸取3.0 mL 于50 mL容量瓶中定容，分別測得ΔA直和ΔA支，代入回歸方程求出直鏈淀粉和支鏈淀粉的質(zhì)量分數(shù)。

2　結(jié)果與討論

2.1淀粉合成酶活性測定結(jié)果

經(jīng)測定K5與對照組間淀粉合成酶的活性，結(jié)果表明見表1。對照組GBSS、SSS的活性依次為0.907、1.777，K5中的依次為0.573、0.957。采用SPSS軟件獨立樣本t檢驗，K5與對照組間的GBSS活性t=14.586、df=4、p＜0.05，SSS的活性t=30.513、 df=4、p＜0.05。方差分析結(jié)果均為差異顯著。說明K5與對照組間淀粉合成酶活性平均值差異顯著。

表1　淀粉合成酶活性測定結(jié)果Table 1 Result of starch synthase activity

2.2樣品中總淀粉質(zhì)量分數(shù)測定結(jié)果

以蒽酮比色測定的淀粉OD625 nm值為縱坐標，淀粉溶液濃度為橫坐標繪制總淀粉含量標準曲線，依據(jù)最小二乘法建立回歸方程為：y=0.060 15x-0.000 73，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 3，見圖1。將K5和對照組的OD625 nm帶入方程中得淀粉的質(zhì)量濃度，最后換算成每克微型薯干物質(zhì)中淀粉的質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果見表2。從表2可知K5及對照組的干物質(zhì)中淀粉的含量分別是77.25%和72.80%。其相對標準偏差RSD均小于1%，表明測定值具有較高的精度。

圖1　淀粉吸收標準曲線Fig. 1 Standard curve of starch

表2　總淀粉重復性試驗結(jié)果Table 2 Results of repeated determinations of potato starch

2.3直鏈淀粉和支鏈淀粉的檢測波長及回歸程

依據(jù)碘-直鏈淀粉、碘-支鏈淀粉復合物的掃描光譜圖獲得直鏈淀粉和支鏈淀粉的最大吸收波長分別是633 nm和559 nm，采用作圖法選定直鏈淀粉測定波長λ1為633 nm，參比波長λ2為473 nm，支鏈淀粉測定波長λ3為559 nm，參比波長λ4為743 nm，見圖2。

圖2　直連、支鏈淀粉測定波長與參比波長的確定Fig. 2　 UV -visible scanning spectra of amylose and amylopectin standards

依據(jù)最小二乘法建立一元化線性回歸方程，直鏈淀粉：c直=6.751 66ΔA直-0.001 8（相關(guān)系數(shù)：R2= 0.999 4）。支鏈淀粉：c支=6.016 01ΔA支-0.001 1（相關(guān)系數(shù)：R2=0.999 7）。

2.4淀粉質(zhì)量分數(shù)測定結(jié)果

通過回歸方程求得直鏈，支鏈淀粉及總淀粉的質(zhì)量分數(shù)見表3。從表3可知，K5中直鏈、支鏈淀粉、總淀粉的質(zhì)量分數(shù)依次為5.00%、71.67%、76.67%，對照組直鏈、支鏈淀粉、總淀粉的質(zhì)量分數(shù)依次為18.33%、51.67%、70.00%。其相對標準偏差RSD均小于1%，表明測定值具有較高的精度。由表4可得K5與對照組的直鏈與支鏈淀粉的比值依次為1/14、1/3。用SPSS軟件進行獨立樣本t檢驗，K5與對照組間的直鏈淀粉質(zhì)量分數(shù)t=23.880、df=4、p＜0.05，支鏈淀粉質(zhì)量分數(shù)t=11.798、df=4、p＜0.05，總淀粉質(zhì)量分數(shù)t=5.167、df=4、p＜0.05，方差分析結(jié)果均為差異顯著。說明K5與對照組間直鏈淀粉、支鏈淀粉及總淀粉質(zhì)量分數(shù)平均值差異顯著。

表3　直鏈淀粉、支鏈淀粉測定重復性試驗Table 3 Results of repeated determinations of amylose and amylopectin in potato starch

表4　微型薯直鏈、支鏈及總淀粉質(zhì)量分數(shù)Table 4 Experiment results of amyloy，amylopectin and starch sample

3　結(jié)語

與對照組相比，K5中的GBSS、SSS活性均有所降低且差異顯著。同時，對照組中直鏈淀粉、支鏈淀粉質(zhì)量分數(shù)依次是K5的3.67倍、0.72倍。直鏈淀粉/支鏈淀粉比例在對照組、K5中依次為1/3和1/14，對照組總淀粉質(zhì)量分數(shù)也低于K5且差異顯著。可見，轉(zhuǎn)基因微型薯K5與對照相比，在總淀粉質(zhì)量分數(shù)上升的基礎(chǔ)上，其直鏈淀粉/支鏈淀粉比例大幅度下降，即直鏈淀粉質(zhì)量分數(shù)顯著下降，支鏈淀粉質(zhì)量分數(shù)明顯提高。初步表明轉(zhuǎn)基因馬鈴薯試管苗結(jié)出的微型薯具有直鏈淀粉質(zhì)量分數(shù)低，且淀粉總量有所提高。同時也表明通過基因工程技術(shù)利用RNAi對馬鈴薯塊莖內(nèi)源gbss、ssⅢ和ssⅡ基因進行同時干擾所得結(jié)果與實驗預期基本相符[14，21]，但轉(zhuǎn)基因微型薯塊莖中淀粉的天然結(jié)構(gòu)，支鏈淀粉鏈長、糊化溫度和優(yōu)良凝沉特性是否達到實驗預期目標，還有待對其進一步研究。

鮮馬鈴薯淀粉質(zhì)量分數(shù)一般在9%～20%，本實驗測得微型薯總淀粉質(zhì)量分數(shù)為11%左右，相對較低，可能是總淀粉質(zhì)量分數(shù)與微型薯品種、栽培條件及微型薯本身成熟度等因素有關(guān)，也可能是微型薯在超低溫保存時沒能經(jīng)殺青處理造成淀粉質(zhì)量分數(shù)的下降，除此之外還可能與馬鈴薯塊莖太小有關(guān)。

高氯酸水解－蒽酮比色法測得總淀粉質(zhì)量分數(shù)高于雙波長法，原因可能是高氯酸水解－蒽酮比色法無法排除樣品中天然可溶性糖分對蒽酮法測定的干擾，此外高氯酸是強酸，使微型薯中的纖維素等碳水化合物產(chǎn)生葡萄糖類似物而引起[17]。

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Study on Amylosynthease Activity and the Change of Starch Content in Transgenic Potato Tuber

CHEN Guoliang1，2，TIAN Ruikang1，2，MA Jingfeng1，2，YANG Chengcheng1，2，AN Peng1，2
（1. College of Life Science，Yan'an University，Yan'an 716000，China；2. Shaanxi Key Laboratory of Chinese Jujube，Yan'an 716000，China）

Abstract：The contents of amylose，amylopectin and total starch were determined via Dual-wavelength spectrophotometry and Anthrone colorimetry in transgenic potato tubers，respectively. Furthermore，activities of GBSS，SSS were measured. Independent samples t test were performed by using statistical SPSS software. The results showed that the contents of total starch and amylopectin in transgenic potato tubers（K5）were significantly higher than that in control group，while activities of GBSS，SSS and the amylose content of K5 decreased significantly. This indicated that synthase gene of transgenic potato was affected by RNA interference in some extent.

Keywords：transgenic potato，starch content，amylose，amylopectin，amylosynthease

作者簡介：陳國梁（1974—），男，陜西定邊人，理學碩士，副教授，碩士研究生導師，主要從事植物生物技術(shù)方面的研究。E-mail：glc9359@163.com

基金項目：延安市農(nóng)業(yè)攻關(guān)項目（2011kn-09）；延安大學高水平大學建設(shè)項目（2012SXTS06）；延安大學校級科研項目（YD2014-01）；地方高校國家級大學生創(chuàng)新訓練計劃項目（201410719041）。

收稿日期：2014-09-08

中圖分類號：S 330.2

文獻標志碼：A

文章編號：1673—1689（2016）02—0219—05