姜辣，陳海燕，張婧，崔亞敏，孟祥紅

(中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島，266003)

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ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對(duì)擴(kuò)展青霉生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的影響

姜辣，陳海燕，張婧，崔亞敏，孟祥紅*

(中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島，266003)

摘要通過固體和液體兩種培養(yǎng)方式，探究了ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對(duì)擴(kuò)展青霉菌體生長(zhǎng)和展青霉素產(chǎn)生的影響。結(jié)果表明，固體培養(yǎng)方式下，ε-聚賴氨酸鹽酸鹽可以顯著地抑制擴(kuò)展青霉孢子萌發(fā)和菌體生長(zhǎng)，且具有濃度依賴性。液體培養(yǎng)方式下，不同濃度的ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對(duì)擴(kuò)展青霉菌體生長(zhǎng)的影響不同，但是均明顯地抑制毒素的產(chǎn)生。其中1.2 mg/mL ε-聚賴氨酸鹽酸鹽在一定時(shí)間內(nèi)可以顯著地抑制擴(kuò)展青霉菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)毒，但在培養(yǎng)后期抑制作用減弱，并促進(jìn)了產(chǎn)毒。

關(guān)鍵詞ε-聚賴氨酸鹽酸鹽；擴(kuò)展青霉；產(chǎn)毒；生長(zhǎng)

擴(kuò)展青霉(Penicilliumexpansum)是果蔬采后的主要病原菌之一，廣泛存在于蘋果、梨、葡萄、柑橘和桃等水果中[1-2]，它不僅會(huì)導(dǎo)致水果的腐爛，而且還會(huì)產(chǎn)生一種次級(jí)代謝產(chǎn)物——展青霉素(Patulin)。展青霉素具有潛在的細(xì)胞和動(dòng)物毒性，存在致畸性、致癌性和免疫毒性[3]，嚴(yán)重危害人體健康，世界上許多國家已經(jīng)對(duì)水果及其加工制品中的展青霉素含量做出了嚴(yán)格的限定[4]。

化學(xué)殺菌劑是控制采后病害的主要方法，但殺菌劑的化學(xué)殘留對(duì)人類健康及環(huán)境的影響已引起關(guān)注，同時(shí)由于病原菌變異和耐藥性的產(chǎn)生，使得化學(xué)殺菌劑的應(yīng)用越來越受到限制。因此，尋求安全、高效的抑菌物質(zhì)來代替化學(xué)殺菌劑用于控制采后病害一直是國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)[5]。目前，已有將殼聚糖和植物精油用于控制采后病害的報(bào)道[6-7]，但殼聚糖不溶于水，黏度高，其抑菌效果受分子量大小和脫乙酰度的影響，而植物精油易揮發(fā)，不容易控制，有些植物精油還具有強(qiáng)烈的刺激性氣味，應(yīng)用領(lǐng)域受到限制。ε-聚賴氨酸作為一種食品添加劑，具有來源廣泛、水溶性好、熱穩(wěn)定性和安全性高[8-10]等優(yōu)點(diǎn)。有研究表明，ε-聚賴氨酸具有良好的抑菌效果，劉蔚等[11]以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、青霉為研究對(duì)象，確定了ε-聚賴氨酸對(duì)3種菌的最小抑菌質(zhì)量濃度分別為25、25和400 mg/L。YE等[12]研究發(fā)現(xiàn)，ε-聚賴氨酸對(duì)大腸桿菌(E. coliO157:H7)具有明顯的抑菌效果，ε-聚賴氨酸能夠破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)；誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生，激活細(xì)胞中氧脅迫基因的表達(dá)；并能激活細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)應(yīng)答(SOS應(yīng)答)機(jī)制，對(duì)菌體DNA造成一定程度的損傷。之前有關(guān)ε-聚賴氨酸抑菌作用的研究主要集中在對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用和機(jī)理方面的探究，但ε-聚賴氨酸對(duì)真菌生長(zhǎng)方面的研究、尤其是對(duì)擴(kuò)展青霉菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的影響卻鮮有報(bào)道。

本文通過固體和液體2種培養(yǎng)方式，探究了ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對(duì)擴(kuò)展青霉孢子萌發(fā)、菌體生長(zhǎng)和展青霉素產(chǎn)生的影響，以期為ε-聚賴氨酸鹽酸鹽在采后病害控制中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

ε-聚賴氨酸鹽酸鹽， 浙江新銀象生物工程有限公司；乙腈(色譜純)， 德國Merck公司；冰乙酸(色譜純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；展青霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)， 美國Sigma公司；超純水，美國Millipore超純水系統(tǒng)；其他試劑均為分析純。擴(kuò)展青霉(Penicillium expansun)由實(shí)驗(yàn)室從感染青霉病的發(fā)病蘋果果實(shí)中分離純化，回接驗(yàn)證所得(經(jīng)鑒定編號(hào)為M1)，于4 ℃ PDA斜面培養(yǎng)基中保存。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，自然pH。

PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 L，自然pH。

1.2儀器與設(shè)備

BMJ-250C霉菌培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BK5000-LEDR光學(xué)顯微鏡，重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司；Agilent-1260高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；IS-RDS3恒溫振蕩器，美國精騏有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海榮生化學(xué)儀器廠；YGC-12氮吹儀，鄭州寶晶電子科技有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1擴(kuò)展青霉孢子懸浮液及其菌餅的制備

將擴(kuò)展青霉接種到PDA斜面上，25 ℃下培養(yǎng)7d后，加入無菌生理鹽水，將菌落表面的孢子刮下，用滅菌的4層紗布過濾除去菌絲等雜質(zhì)，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將孢子濃度調(diào)整至106CFU/mL。

取一定體積的孢子懸浮液制備成含孢子濃度為105CFU/mL的PDA培養(yǎng)基，混勻后以每皿10 mL添加量倒入直徑為90 mm的無菌培養(yǎng)皿中制成平板。用無菌打孔器在含菌培養(yǎng)基上打孔得到直徑為9 mm的圓形菌餅。本實(shí)驗(yàn)均在經(jīng)紫外線殺菌的無菌操作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。

1.3.2孢子萌發(fā)試驗(yàn)

制備ε-聚賴氨酸鹽酸鹽質(zhì)量濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL的PDA培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH為5.6。混勻后以每皿10 mL添加量倒入直徑為90 mm的無菌培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固后，均勻涂布100 μL擴(kuò)展青霉孢子懸浮液。將培養(yǎng)皿置于25 ℃，相對(duì)濕度90%的霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9.5 h后，在顯微鏡下觀察，以孢子芽管超過孢子直徑視為萌發(fā)[13]，并計(jì)算孢子萌發(fā)率。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行樣中至少統(tǒng)計(jì)200個(gè)孢子。

1.3.3固體培養(yǎng)條件下抑菌試驗(yàn)

制備ε-聚賴氨酸鹽酸鹽質(zhì)量濃度分別為0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、20.0 mg/mL的PDA培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH 為5.6?；靹蚝笠悦棵?5 mL添加量倒入直徑為90 mm的無菌培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固后，取含有擴(kuò)展青霉孢子懸液的菌餅置于培養(yǎng)皿中央。將培養(yǎng)皿置于25 ℃，相對(duì)濕度90%的霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后，直至對(duì)照組的菌落直徑生長(zhǎng)至培養(yǎng)皿直徑1/2～2/3時(shí)[14]，用十字交叉法測(cè)量各處理組的菌落直徑，計(jì)算抑制率:

每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。

1.3.4液體培養(yǎng)條件下菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)毒試驗(yàn)

1.3.4.1擴(kuò)展青霉生長(zhǎng)量的測(cè)定

制備ε-聚賴氨酸鹽酸鹽質(zhì)量濃度為0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、4.0 mg/mL的PDB培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH為5.6。混勻后以每瓶40 mL添加量置于250 mL無菌錐形瓶中，接入0.4 mL 1×106CFU/mL 的擴(kuò)展青霉孢子懸浮液，用透氣的封瓶膜封口。將錐形瓶置于25 ℃，相對(duì)濕度90%的霉菌培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng) 7d。其中將質(zhì)量濃度為0和1.2 mg/mL的處理組分別培養(yǎng)5，7，9，11，13 d。培養(yǎng)結(jié)束后抽濾收集菌體，于60 ℃下烘干至恒重，稱重，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。

1.3.4.2展青霉素的測(cè)定

展青霉素測(cè)定采用高效液相色譜法，參考測(cè)定方法[15]。量取10 mL抽濾所得濾液，用于提取測(cè)量展青霉素，向待測(cè)樣品中加入15 mL乙酸乙酯振蕩提取1 h，靜置分層后，收集上層的乙酸乙酯相。重復(fù)2次，合并有機(jī)相，加入10 mL Na2CO3溶液(15 mg/mL)，振蕩1 min，靜置分層后，再用10 mL的乙酸乙酯對(duì)Na2CO3層提取1次，合并乙酸乙酯提取液，于40 ℃水浴上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至液體剩余1～2 mL，將濃縮液轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中，于40 ℃下氮?dú)獯蹈?，?.0 mL乙酸水溶液(pH=4.0)溶解殘留物，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，用HPLC進(jìn)行測(cè)定。色譜柱：Agilent SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(10∶90,體積比)；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)276 nm；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.4.3pH和還原糖的測(cè)定

將濾除菌體的濾液用于以下指標(biāo)的測(cè)定：pH值采用酸度計(jì)測(cè)定；還原糖采用DNS比色法測(cè)定[16]。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS(Version 20.0, Inc., Chicago, IL, USA)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過ANOVA進(jìn)行鄧肯多重比較。當(dāng)P< 0.05時(shí)，即表示差異顯著。

2結(jié)果與討論

2.1ε-聚賴氨酸鹽酸鹽質(zhì)量濃度對(duì)擴(kuò)展青霉孢子萌發(fā)的影響

如圖1所示，培養(yǎng)9.5 h后，對(duì)照組的孢子萌發(fā)率達(dá)到87.3 %± 1.0%，而0.4 mg/mL ε-聚賴氨酸鹽酸鹽組孢子萌發(fā)率為(5.4±1.0)%。擴(kuò)展青霉孢子培養(yǎng)9.5 h后，用顯微鏡觀察，對(duì)照組孢子幾乎全部萌發(fā)，而0.4 mg/mL ε-聚賴氨酸鹽酸鹽組孢子基本沒有萌發(fā)，多數(shù)孢子還沒有完成萌發(fā)所必須的體積膨大過程(圖2)。說明ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對(duì)擴(kuò)展青霉孢子萌發(fā)具有明顯的抑制作用，其抑制作用強(qiáng)弱依賴于濃度的變化。這與β-氨基丁酸(BABA)對(duì)擴(kuò)展青霉孢子萌發(fā)的研究結(jié)果[17]是一致的。

圖1　ε-聚賴氨酸鹽酸鹽質(zhì)量濃度對(duì)擴(kuò)展青霉孢子萌發(fā)的影響Fig.1　Effect of ε-poly-L-lysine·HCl with different concentrations on spore germination of P. expansum

圖2　ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對(duì)擴(kuò)展青霉孢子形態(tài)的影響Fig.2　Effect of ε-poly-L-lysine·HCl on spore morphology of P. expansum

2.2固體培養(yǎng)方式下ε-聚賴氨酸鹽酸鹽質(zhì)量濃度對(duì)擴(kuò)展青霉菌體生長(zhǎng)的影響

如圖3a所示，培養(yǎng)至第7天時(shí)，對(duì)照組的菌餅直徑達(dá)到(50.7±0.1) mm。0.4 mg/mL ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對(duì)擴(kuò)展青霉菌體生長(zhǎng)的抑制率為21.9%±0.1%，隨著濃度的升高，ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制作用逐漸增強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到20 mg/mL時(shí)，抑制率為(68.6±3.6)%(圖3b)。說明固體培養(yǎng)方式下，ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對(duì)擴(kuò)展青霉菌體生長(zhǎng)的抑制具有濃度依賴性。

圖3　固體培養(yǎng)方式下ε-聚賴氨酸鹽酸鹽質(zhì)量濃度對(duì)擴(kuò)展青霉菌體生長(zhǎng)的影響Fig.3　Effect of ε-poly-L-lysine·HCl with different concentrations on the mycelial growth of P. expansum in solid medium

2.3液體培養(yǎng)方式下ε-聚賴氨酸鹽酸鹽質(zhì)量濃度對(duì)擴(kuò)展青霉菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的影響

考慮到菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)毒過程中會(huì)引起培養(yǎng)環(huán)境發(fā)生變化，因此，采用液體培養(yǎng)的方式來探究ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對(duì)擴(kuò)展青霉菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的影響。由表1可以看出，液體培養(yǎng)方式下，相同培養(yǎng)時(shí)間(7 d)內(nèi)，ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對(duì)擴(kuò)展青霉菌體生長(zhǎng)的抑制作用并不呈現(xiàn)濃度依賴性。在ε-聚賴氨酸鹽酸鹽濃度為1.2 mg/mL時(shí)，對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制效果最好。但隨著ε-聚賴氨酸鹽酸鹽濃度的升高，抑制作用逐漸減弱。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到2.0 mg/mL以上時(shí)，擴(kuò)展青霉菌體生長(zhǎng)量與對(duì)照組相當(dāng)。分析可能的原因是液體培養(yǎng)方式下，ε-聚賴氨酸鹽酸鹽分子中大量帶正電荷的基團(tuán)與菌體表面的吸附作用，使菌體生長(zhǎng)量增加，劉勝榮[18]的研究也發(fā)現(xiàn)，生理?xiàng)l件下，ε-聚賴氨酸可以大量的吸附至產(chǎn)生菌細(xì)胞。也可能是液體培養(yǎng)方式下，高濃度的ε-聚賴氨酸鹽酸鹽促進(jìn)了菌體的生長(zhǎng)，使菌體生長(zhǎng)量增加。張昕等[19]的研究表明還原糖的降低與菌體生長(zhǎng)量的上升具有一致性，這與本研究中高濃度處理組菌體對(duì)還原糖的消耗要高于1.2 mg/mL處理組的結(jié)果具有一致性。

表1液體培養(yǎng)方式下ε-聚賴氨酸鹽酸鹽質(zhì)量濃度對(duì)擴(kuò)展青霉菌體生長(zhǎng)量、毒素含量及相關(guān)指標(biāo)的影響

Table1Effect of ε-poly-L-lysine·HCl with different concentrations on the mycelial growth ofP.expansum, the production of patulin and the related indicators in liquid medium

處理濃度/(mg·mL-1)菌體干重/mg毒素濃度/(μg·mL-1)還原糖/(mg·mL-1)pH值00.40.81.21.62.03.04.0348.7±7.1ae333.0±8.6ab319.3±6.1b277.6±16.7c321.4±17.9b333.1±2.1ab363.1±12.4e368.9±6.1e221.3±11.2a192.5±22.4a135.4±25.6b82.2±22.4c93.6±23.6c104.3±30.8bc111.0±11.1bc110.4±8.1bc0.9±0.0a8.0±0.5b9.5±0.5c11.4±0.5d8.1±0.5b8.0±0.3b6.9±0.7e5.6±0.5f3.6±0.1ab3.7±0.1b3.6±0.1ab3.7±0.0b3.7±0.1b3.5±0.1ac3.4±0.1cd3.4±0.0cd

注：不同小寫字母代表同種指標(biāo)不同濃度處理間差異顯著(P<0.05)

相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，與對(duì)照組相比，ε-聚賴氨酸鹽酸鹽能夠明顯地抑制產(chǎn)毒，隨著ε-聚賴氨酸鹽酸鹽濃度的升高，產(chǎn)毒呈現(xiàn)先降低后保持平緩的變化趨勢(shì)。其中對(duì)菌體生長(zhǎng)抑制效果最明顯的1.2 mg/mL ε-聚賴氨酸鹽酸鹽組，其產(chǎn)毒受到強(qiáng)烈抑制?？赡苁窃摑舛鹊摩?聚賴氨酸鹽酸鹽強(qiáng)烈的抑制了菌體生長(zhǎng)而阻止了菌體產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物，因而降低了產(chǎn)毒[20]。而高濃度處理組雖然對(duì)菌體生長(zhǎng)量無顯著影響但卻明顯地降低了產(chǎn)毒。關(guān)于抑菌劑對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)毒不一致的情況在其他的研究中也有報(bào)道。例如，MOSSINI等[21]研究發(fā)現(xiàn)，含有槲皮素和其他酚類物質(zhì)的苦楝樹葉提取物不抑制擴(kuò)展青霉菌體生長(zhǎng)，但是卻能夠抑制展青霉素的產(chǎn)生，這與本研究結(jié)果一致。但關(guān)于其產(chǎn)毒的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，各處理組還原糖均明顯降低。但是與對(duì)照組相比，ε-聚賴氨酸鹽酸鹽組均顯著降低了對(duì)還原糖的消耗。其中菌體生長(zhǎng)量最小的1.2 mg/mL ε-聚賴氨酸鹽酸鹽組其還原糖的消耗最少。說明菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的過程中需要消耗還原糖。相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，各處理組的pH均明顯降低。說明在擴(kuò)展青霉菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的過程中會(huì)產(chǎn)酸。PRUSKY等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)展青霉生長(zhǎng)過程中會(huì)分泌有機(jī)酸，如葡萄糖酸，而展青霉素也在酸性條件下產(chǎn)生。NERI等[23]研究也發(fā)現(xiàn)，展青霉素產(chǎn)生比較弱的擴(kuò)展青霉菌株并不能酸化基質(zhì)。這與本研究結(jié)果一致。

2.4液體培養(yǎng)方式下ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對(duì)擴(kuò)展青霉菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)毒隨時(shí)間變化的影響

相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，1.2 mg/mL ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對(duì)擴(kuò)展青霉菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的抑制效果最明顯，因此選擇該質(zhì)量濃度來探究其對(duì)擴(kuò)展青霉菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)毒隨時(shí)間變化的影響。由圖4a可以看出，對(duì)照組從培養(yǎng)第5～13天，菌體生長(zhǎng)量變化不明顯。而ε-聚賴氨酸鹽酸鹽組，從培養(yǎng)第5～9天菌體生長(zhǎng)量一直增加，但低于對(duì)照組。從第11天開始，菌體生長(zhǎng)量與對(duì)照組相當(dāng)，變化不明顯。說明ε-聚賴氨酸鹽酸鹽在一定時(shí)間內(nèi)抑制了擴(kuò)展青霉菌體生長(zhǎng)。

圖4　液體培養(yǎng)方式下ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對(duì)擴(kuò)展青霉菌體生長(zhǎng)量、毒素含量及相關(guān)指標(biāo)隨時(shí)間變化的影響Fig.4　Effect of ε-poly-L-lysine·HCl with different time on the mycelial growth of P. expansum, the production of patulin and the related indicators in liquid medium

由圖4b可以看出，在培養(yǎng)過程中，對(duì)照組與ε-聚賴氨酸鹽酸鹽組產(chǎn)毒均呈現(xiàn)先上升后降低的變化趨勢(shì)。對(duì)照組在培養(yǎng)的第7天達(dá)到產(chǎn)毒高峰，而ε-聚賴氨酸鹽酸鹽組在培養(yǎng)的第5～9天產(chǎn)毒一直在增加，但一直低于對(duì)照組，當(dāng)培養(yǎng)至第11天時(shí)，ε-聚賴氨酸鹽酸鹽組產(chǎn)毒達(dá)到高峰，并高于對(duì)照組。說明ε-聚賴氨酸鹽酸鹽在一定時(shí)間內(nèi)抑制了產(chǎn)毒。而在培養(yǎng)過程中ε-聚賴氨酸鹽酸鹽組出現(xiàn)了產(chǎn)毒高于對(duì)照組的情況，可能是因?yàn)棣?聚賴氨酸鹽酸鹽提供了一個(gè)菌體生長(zhǎng)的“逆境”環(huán)境，使病原真菌更傾向于向次級(jí)代謝產(chǎn)物的方向合成[24]。展青霉素是擴(kuò)展青霉的次級(jí)代謝產(chǎn)物，培養(yǎng)前期ε-聚賴氨酸鹽酸鹽強(qiáng)烈的抑制菌體生長(zhǎng)，而抑制產(chǎn)毒，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，這種“逆境”下的菌體不斷生長(zhǎng)，因而促進(jìn)了擴(kuò)展青霉產(chǎn)生更多的次級(jí)代謝產(chǎn)物，使產(chǎn)毒增加。在培養(yǎng)過程中，對(duì)照組與ε-聚賴氨酸鹽酸鹽組產(chǎn)毒分別從培養(yǎng)的第7和11天開始降低。

如圖4c所示，對(duì)照組與ε-聚賴氨酸鹽酸鹽組在培養(yǎng)過程中還原糖都隨著時(shí)間的增加而逐漸降低，分別在培養(yǎng)的第7，11天達(dá)到最低值，隨后兩組還原糖變化不明顯。而pH均呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢(shì)，對(duì)照組與ε-聚賴氨酸鹽酸鹽組分別在培養(yǎng)的第5，9天達(dá)到最低值，隨后開始上升 (圖4d)。這說明菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的過程中需要不斷地消耗還原糖，并產(chǎn)酸。而培養(yǎng)后期各處理組還原糖達(dá)到最低值后變化不明顯，以及pH值的升高，這可能與培養(yǎng)后期產(chǎn)毒降低有一定的關(guān)系。由于營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，展青霉素合成被終止，同時(shí)培養(yǎng)液的pH發(fā)生改變，會(huì)導(dǎo)致展青霉素不穩(wěn)定，而發(fā)生降解。VARGA等[25]也認(rèn)為，毒素可以被菌體自身降解，同時(shí)由于營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，真菌毒素的產(chǎn)生或積累可以被終止，這與本研究結(jié)果一致。

3結(jié)論

本研究通過固體和液體兩種培養(yǎng)方式，探究了ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對(duì)擴(kuò)展青霉菌體生長(zhǎng)和展青霉素產(chǎn)生的影響，結(jié)果表明：固體培養(yǎng)方式下，ε-聚賴氨酸鹽酸鹽能夠顯著地抑制擴(kuò)展青霉孢子萌發(fā)和菌體生長(zhǎng)，且具有濃度依賴性。液體培養(yǎng)方式下，ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對(duì)擴(kuò)展青霉菌體生長(zhǎng)的抑制作用并不呈現(xiàn)濃度依賴性，當(dāng)濃度達(dá)到2.0 mg/mL以上時(shí)，擴(kuò)展青霉菌體生長(zhǎng)量與對(duì)照組相當(dāng)，因此要注意不同的培養(yǎng)方式對(duì)其發(fā)揮抑菌作用的影響，但是不同濃度的ε-聚賴氨酸鹽酸鹽均明顯地抑制了產(chǎn)毒，關(guān)于其產(chǎn)毒的機(jī)制還有待深入研究；其中1.2 mg/mL ε-聚賴氨酸鹽酸鹽在一定時(shí)間內(nèi)可以顯著地抑制擴(kuò)展青霉菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)毒，但在培養(yǎng)后期對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的抑制作用減弱，并促進(jìn)了產(chǎn)毒。因此，對(duì)ε-聚賴氨酸鹽酸鹽進(jìn)行抑菌性評(píng)價(jià)時(shí)，應(yīng)該考慮培養(yǎng)方式對(duì)其抑菌作用的影響，同時(shí)更應(yīng)重視其對(duì)產(chǎn)毒的影響。本文的研究結(jié)果可為ε-聚賴氨酸鹽酸鹽在采后病害控制中的應(yīng)用提供依據(jù)。

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Effects of ε-poly-L-lysine·HCl on growth ofPenicilliumexpansumand production of patulin

JIANG La，CHEN Hai-yan，ZHANG Jing，CUI Ya-min，MENG Xiang-hong*

(College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China)

ABSTRACTEffects of ε-poly-L-lysine·HCl on the growth of Penicillium expansum and the production of patulin were investigated in solid and liquid medium. The results showed that ε-poly-L-lysine·HCl obviously inhibited spore germination and the growth of Penicillium expansum with increasing dose in solid medium. Treatment with different concentrations of ε-poly-L-lysine·HCl had different effects on the growth of Penicillium expansum. However, it could obviously reduce the production of patulin in liquid medium. Particularly, 1.2 mg/mL ε-poly-L-lysine·HCl significantly inhibited the growth of Penicillium expansum and the production of patulin within a certain time，but weakened inhibiting at the end of cultivation, even promoted the production of patulin. This study provides foundation for application of ε-poly-L-lysine·HCl in controlling of postharvest diseases.

Key wordsε-poly-L-lysine·HCl；Penicillium expansum；patulin；growth

收稿日期：2015-11-10，改回日期：2015-12-06

基金項(xiàng)目：國家科技計(jì)劃課題(863計(jì)劃)(2012AA101607); 國家自然科學(xué)基金(31171762)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201604008

第一作者：碩士研究生(孟祥紅教授為通訊作者，E-mail : mengxh@ouc.edu.cn)。