彭桂瑩,陳永玲,韓玉珍,張庭廷(安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,安徽省皖江城市帶退化生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)與重建協(xié)同創(chuàng)新中心,安徽 蕪湖 241000)

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乳酸對(duì)銅綠微囊藻的抑藻效應(yīng)及機(jī)理

彭桂瑩,陳永玲,韓玉珍,張庭廷*(安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,安徽省皖江城市帶退化生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)與重建協(xié)同創(chuàng)新中心,安徽 蕪湖 241000)

摘要：以銅綠微囊藻為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,研究了乳酸對(duì)銅綠微囊藻的抑藻效果及可能的抑藻機(jī)理.結(jié)果表明乳酸對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)有很強(qiáng)的抑制作用,72h,除最低濃度實(shí)驗(yàn)組對(duì)銅綠微囊藻的抑制率為60%外,其余濃度實(shí)驗(yàn)組的抑制率均達(dá)到了80%以上;在乳酸脅迫下,藻液中核酸和蛋白質(zhì)含量增加,電導(dǎo)率上升,細(xì)胞中丙二醛(MDA)和氧自由基(O2?)含量增加,超氧化物歧化酶(SOD)活性下降;透射電鏡圖片顯示,細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯改變.推測(cè)乳酸可能的抑藻機(jī)理是改變了藻細(xì)胞膜的通透性及其細(xì)胞結(jié)構(gòu),降低了其抗氧化能力,最終使得藻細(xì)胞裂解死亡.

關(guān)鍵詞：乳酸；銅綠微囊藻；抑藻效應(yīng)；抑制機(jī)理

* 責(zé)任作者, 教授, cyhztt@mail.ahnu.edu.cn

水體富營(yíng)養(yǎng)化現(xiàn)象,已成為日益嚴(yán)重的全球性水環(huán)境污染問題之一[1].目前,利用天然植物產(chǎn)生的次生代謝物進(jìn)行抑藻是環(huán)境領(lǐng)域研究的熱點(diǎn).如沉水植物穗花狐尾藻分泌的焦性沒食子酸被認(rèn)為是一種抑藻效應(yīng)較強(qiáng)的化感物質(zhì)[2],而Zhang等[3]從普生輪藻中分離到的亞油酸等也同樣表現(xiàn)出非常好的抑藻作用;張庭廷等[4]對(duì)17種不同結(jié)構(gòu)脂肪酸的抑藻效應(yīng)研究發(fā)現(xiàn)所有脂肪酸均有不同程度的抑藻作用.但脂肪酸和酚酸類化感物質(zhì)在應(yīng)用時(shí)有一個(gè)重要的瓶頸,即難溶問題,因此,尋找那些易于溶解且具有良好抑藻效果的天然低毒或無(wú)毒代謝物進(jìn)行藍(lán)藻水華的防治就顯得異常重要.

乳酸(2-羥基丙酸)是某些植物無(wú)氧呼吸的代謝產(chǎn)物,已有相關(guān)報(bào)道認(rèn)為乳酸是一些植物的化感成分之一,如Xian等[5]分析3種沉水植物分泌的化感物質(zhì)成分時(shí),在金魚藻、黑藻和苦草的水培液中都檢測(cè)到了含量相對(duì)較高的乳酸;王紅強(qiáng)等[6]也從伊樂藻的水浸提液中檢測(cè)到了乳酸成分.此外,乳酸可作為食品添加劑、防腐劑,且無(wú)異味,能與水任意互溶,可以方便地直接投入水體使用.因此,采用乳酸進(jìn)行抑藻不僅具有較好的生態(tài)安全性且使用方便,易于操作,具有較高的可行性.

為此,本研究利用單純的天然產(chǎn)物乳酸對(duì)水華最常見的藍(lán)藻—銅綠微囊藻進(jìn)行抑藻實(shí)驗(yàn)并測(cè)定了其抑藻機(jī)理,力求為富營(yíng)養(yǎng)化水體藍(lán)藻水華防治提供新的研究思路和有用參考.

1　材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

銅綠微囊藻PCC7806(Microcystis aeruginosa PCC7806) 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所藻種庫(kù),采用BG-11培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng).培養(yǎng)條件為4000lx 的光照強(qiáng)度,光暗比為12h:12h,溫度為(25±1)℃.實(shí)驗(yàn)前一周,銅綠微囊藻進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),使得細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期.

乳酸為分析純,含量99%,購(gòu)自于上海國(guó)藥集團(tuán).

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

超凈工作臺(tái);Motic數(shù)碼顯微鏡;血球計(jì)數(shù)板;光照培養(yǎng)箱PGX-250B;離心機(jī);TGL-16G冷凍離心機(jī);721型分光光度計(jì)等,Jeol 1230透射電鏡. 1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸對(duì)銅綠微囊藻的抑藻實(shí)驗(yàn) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,在已滅菌的錐形瓶中(250mL)加入銅綠微囊藻藻液100mL,藻的初始密度為1.3× 106cells/mL,然后向其中加入一定量的乳酸,乳酸設(shè)置5個(gè)濃度梯度,分別為12.5,25.0,50.0,100.0, 200.0μL/L(由于加入的乳酸量非常小,對(duì)藻液的密度幾乎沒有影響,故其體積可以忽略不計(jì)).另外設(shè)置不含乳酸的空白對(duì)照組,各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均3個(gè)平行,置于1.1相同條件下培養(yǎng).

通過血球計(jì)數(shù)板對(duì)藻細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)來(lái)反映乳酸對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響,每24h計(jì)數(shù)一次,統(tǒng)計(jì)至96h.

通過藻細(xì)胞密度計(jì)算出乳酸對(duì)銅綠微囊藻的百分抑制率(Inhibition Ratio).抑制率的計(jì)算公式為:

式中:IR表示抑制率;N表示處理組的銅綠微囊藻的藻密度,cells/mL;N0表示對(duì)照組的銅綠微囊藻的藻密度,cells/mL.

1.3.2 乳酸對(duì)銅綠微囊藻的部分抑制機(jī)理研究及相關(guān)參數(shù)的測(cè)定 根據(jù)1.3.1的抑藻結(jié)果,對(duì)機(jī)理的測(cè)定,設(shè)置了4個(gè)乳酸濃度梯度,分別為12.5,25.0,50.0,100.0μL/L,其他處理方法同上,初始藻密度為5.35×106cells/mL.24h后測(cè)定各種機(jī)理參數(shù),此后每隔48h測(cè)定一次,總共測(cè)定3次.

細(xì)胞膜通透性通過測(cè)定細(xì)胞外液電導(dǎo)率、OD260、OD280變化[7]來(lái)反映.OD260反映的是藻液中核酸的含量;OD280反映的是藻液中蛋白質(zhì)的含量.

參照Health等[8]硫代巴比妥酸TBA比色法測(cè)定丙二醛(MDA)含量.丙二醛是膜脂過氧化作用的最終分解產(chǎn)物,其含量可以反映細(xì)胞遭受逆境傷害的程度.實(shí)驗(yàn)時(shí)分別測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物在不同光波長(zhǎng)處的吸光值,計(jì)算丙二醛的濃度和含量.

超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定參考修改的Stewert等[9]的方法.SOD是普遍存在于生物體內(nèi)的一種清除超氧陰離子自由基的酶.通過測(cè)定反應(yīng)后反應(yīng)液在560nm處的吸光值,計(jì)算出酶活性的大小.

藻細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的透射電鏡分析:于實(shí)驗(yàn)第3d收集銅綠微囊藻,離心,棄上清,0.1mol/L PBS清洗2次.加2.5%戊二醛過夜固定后,用0.1mol/L PBS清洗2次,再經(jīng)1%鋨酸后固定5h,0.1mol/L PBS清洗數(shù)次后,丙酮梯度濃度脫水,Epon812 樹脂梯度浸透包埋,在60℃恒溫箱聚合成包埋塊, 在Leica UC6超薄切片機(jī)上切片,切片經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛染色后在Jeol 1230透射電鏡上觀察拍照(透射電鏡分析由上海釜誠(chéng)生物科技有限公司協(xié)助完成).

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0和Excel 2010軟件處理,對(duì)組間數(shù)據(jù)的差異進(jìn)行多重比較分析,大寫字母表示P<0.01,說(shuō)明有極顯著性差異;小寫字母表示P<0.05,說(shuō)明有顯著性差異.

2　結(jié)果與分析

2.1 乳酸對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響

由表1可知,乳酸對(duì)銅綠微囊藻的抑制率隨著乳酸濃度的增加而增大;同一濃度下,隨著處理時(shí)間的加長(zhǎng)而增大.除去最低濃度處理組,其余濃度的處理組抑制率在第72h后均超過了80%,在第96h后均超過了90%,最大乳酸濃度(200.0μL/L)組,在第96h抑制率可以達(dá)到99.58%,接近100%.由此可以看出,乳酸對(duì)銅綠微囊藻有很好的抑制作用.

表2中數(shù)據(jù)顯示的是對(duì)不同處理時(shí)間所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行的Pearson相關(guān)性分析.可以看到表中大多數(shù)據(jù)的R≥0.8, P≤0.05.由此可以表明乳酸濃度與抑制效果呈正相關(guān),即乳酸濃度越大,抑制率越大.

表1　乳酸對(duì)銅綠微囊藻的抑制率Table 1　The Inhibition ratio of lactic acid on M.aeruginosa

表2　乳酸濃度與抑制率的相關(guān)性Table 2　The correlation between lactic acid concentration and inhibition ratios

2.2 乳酸對(duì)銅綠微囊藻的抑制機(jī)理

表3　乳酸對(duì)銅綠微囊藻藻液核酸含量的影響Table 3　The effect of lactic acid on nucleic acid contents in the supernatant of M.aeruginosa

表4　乳酸對(duì)對(duì)銅綠微囊藻藻液蛋白質(zhì)含量的影響Table 4　The effect of lactic acid on protein contents in the supernatant of M.aeruginosa

2.2.1 乳酸對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞膜通透性的影響 表3、表4和圖1分別顯示的是銅綠微囊藻藻液中核酸含量(OD260)、蛋白質(zhì)含量(OD280)以及電導(dǎo)率的變化.可以看出,對(duì)照組中核酸和蛋白質(zhì)含量基本保持穩(wěn)定,而各處理組藻液中核酸含量和蛋白質(zhì)含量都隨著乳酸濃度的增大而增加,且隨著處理時(shí)間的加長(zhǎng)而增加.50.0,100.0μL/L處理組在120h時(shí)核酸含量和蛋白質(zhì)含量增加的幅度較兩個(gè)低濃度組較小,但較之前仍在增加,且核酸和蛋白質(zhì)含量在各組間的差異基本上都已經(jīng)達(dá)到了顯著性差異(P<0.05).電導(dǎo)率變化趨勢(shì)與OD260、OD280的變化趨勢(shì)基本相似.這些參數(shù)變化的可能原因是乳酸損傷了銅綠微囊藻的藻細(xì)胞膜,使得細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了改變,細(xì)胞中的核酸和蛋白質(zhì)發(fā)生外滲,從而OD260、OD280的值增大;細(xì)胞內(nèi)小分子物質(zhì)外滲,從而電導(dǎo)率升高.

圖1　乳酸對(duì)銅綠微囊藻藻液電導(dǎo)率的影響Fig.1　The effect of lactic acid on conductivity in the supernatant of M.aeruginosa不同小寫字母表示組間比較P<0.05;不同大寫字母表示組間比較P<0.01

圖2　乳酸對(duì)銅綠微囊藻MDA含量的影響Fig.2　The effect of lactic acid on MDA contents of M.aeruginosa不同小寫字母表示組間比較P<0.05;不同大寫字母表示組間比較P<0.01

2.2.2 乳酸對(duì)銅綠微囊藻MDA含量的影響 從圖2可以看出,對(duì)照組的MDA含量基本保持不變,而實(shí)驗(yàn)組MDA含量隨乳酸濃度的增加而上升,隨著處理時(shí)間的加長(zhǎng)而增高.同時(shí)可以看出,各個(gè)濃度組之間的差異也比較顯著(P< 0.05),個(gè)別組之間的差異甚至達(dá)到了極顯著性(P<0.01). MDA含量的這種變化可能是因?yàn)樵谌樗岬拿{迫作用下,銅綠微囊藻細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化程度加劇,造成了MDA的積累.

含量在逐漸增加,72h時(shí),各濃度組之間的差異基本上都表現(xiàn)為極顯著性差異(P<0.01).表明藻細(xì)胞受到乳酸脅迫后細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化增加,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)含量上升,這與MDA含量上升是一致的.

圖3　乳酸對(duì)銅綠微囊藻O2?含量的影響Fig.3　The effect of lactic acid on O2? contents of M.aeruginosa不同小寫字母表示組間比較P<0.05;不同大寫字母表示組間比較P<0.01

2.2.4 乳酸對(duì)銅綠微囊藻SOD活性的影響 由圖4可知,對(duì)照組銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)的SOD活性基本保持不變,而實(shí)驗(yàn)組中,隨著乳酸濃度的增加,銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)的SOD活性均呈下降的趨勢(shì).最大濃度組(100.0μL/L)在24h時(shí)就已經(jīng)表現(xiàn)出SOD總活性相對(duì)于對(duì)照組有較大的下降幅度,而其它幾個(gè)較低濃度組此時(shí)的SOD總活性相對(duì)于對(duì)照組還未顯示出較大差異,但隨著時(shí)間的延長(zhǎng),其活性也逐漸低于對(duì)照組.當(dāng)藻細(xì)胞受到乳酸脅迫時(shí),細(xì)胞內(nèi)氧自由基濃度上升,而SOD具有清除細(xì)胞內(nèi)自由基的作用,抗氧化體系酶活性理應(yīng)也會(huì)隨之上升,而本實(shí)驗(yàn)中SOD活性下降的可能原因是乳酸對(duì)藻細(xì)胞的協(xié)迫作用比較強(qiáng)烈,大多數(shù)藻細(xì)胞還來(lái)不及產(chǎn)生相應(yīng)的生理應(yīng)對(duì)措施就已經(jīng)死亡(這與乳酸對(duì)銅綠微囊藻抑制率大小的影響結(jié)果2.1相吻合),導(dǎo)致總的蛋白質(zhì)合成量減少,抗氧化酶系統(tǒng)的總活性降低,故呈現(xiàn)下降趨勢(shì).

圖4　乳酸對(duì)銅綠微囊藻SOD活性的影響Fig.4　The effect of lactic acid on SOD activity of M.aeruginosa

圖5　乳酸對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響Fig.5　The effect of lactic acid on cell structure of M.aeruginosaa為對(duì)照組,b、c、d、e依次為乳酸12.5,25.0,50.0,100.0μL/L濃度組

2.2.5 乳酸對(duì)銅綠微囊超微結(jié)構(gòu)的影響 由圖5可看出乳酸對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)破壞明顯,圖5a是對(duì)照組,其細(xì)胞壁完整,膠質(zhì)鞘厚,類囊體清晰,排列整齊;而圖5b類囊體開始彎曲,排列不整齊,膠質(zhì)鞘消失,但整個(gè)細(xì)胞形態(tài)完整,未出現(xiàn)偽空泡;圖5c藻細(xì)胞破壞進(jìn)一步加劇,類囊體分散,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大的偽空泡;圖5d和圖5e細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)混亂,結(jié)構(gòu)破壞,細(xì)胞不完整.可見隨著乳酸用量的加大,在作用相同時(shí)間內(nèi),細(xì)胞破壞程度明顯加重.

2.3 討論

利用植物的化感作用進(jìn)行抑藻已是環(huán)境領(lǐng)域研究者的共識(shí),而植物化感抑藻的原理主要是植物分泌釋放的一些化感物質(zhì)在起作用.植物產(chǎn)生的化感物質(zhì),主要是一些次生代謝產(chǎn)物,它的種類很多,其中相當(dāng)一部分已被分離鑒定,主要有脂肪酸、有機(jī)酸、萜類及酚類物質(zhì)[11-13]等.不少化感物質(zhì)和相關(guān)機(jī)理已被研究[14-16].乳酸也被證實(shí)為某些植物,如金魚藻[6],所分泌的化感物質(zhì)之一,并且他有著優(yōu)于其他大多數(shù)化感物質(zhì)所不具備的物理性質(zhì).

植物化感物質(zhì)抑藻的機(jī)理往往根據(jù)化感物質(zhì)種類的不同而不同[17],且往往同一種物質(zhì)作用的機(jī)理不止一種,而是多種方式共同起作用的.如化感物質(zhì)可以使葉綠素a的含量減少[18],破環(huán)藻的光合系統(tǒng);破環(huán)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)[19],導(dǎo)致膜的完整性喪失;影響細(xì)胞內(nèi)酶的活性[20],從而使其正常生理功能改變;破環(huán)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)[19]以及影響細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)[21]等.

本實(shí)驗(yàn)中乳酸的抑藻結(jié)果表明,較低濃度時(shí)的乳酸即可抑制銅綠微囊藻的生長(zhǎng),抑藻效果明顯.乳酸抑藻部分機(jī)理方面的研究顯示,OD260、OD280、電導(dǎo)率的值隨著乳酸濃度的增加而增大,說(shuō)明藻細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)和小分子物質(zhì)外滲,表明藻細(xì)胞膜在乳酸作用下通透性發(fā)生了改變;和MDA隨著乳酸濃度的增加而增大,揭示出乳酸使銅綠微囊藻細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化程度加劇;SOD活性下降表明藻細(xì)胞的抗氧化酶系統(tǒng)的總活性降低,應(yīng)激能力下降而死亡;透射電鏡圖片顯示,細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯改變.這些測(cè)定結(jié)果符合上述的化感物質(zhì)作用機(jī)理中的幾種.由此推測(cè)乳酸可能的抑藻機(jī)理是改變了藻細(xì)胞膜的通透性及其細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu),降低了其抗氧化能力,最終使得藻細(xì)胞裂解死亡.由于本實(shí)驗(yàn)只研究了乳酸可能的抑藻機(jī)理中的一部分,那么乳酸抑藻是否同時(shí)還存在其它的機(jī)制呢?比如上述機(jī)制中對(duì)基因表達(dá)的影響,對(duì)光和系統(tǒng)的破壞?這仍需進(jìn)一步的研究與探索.

乳酸作為植物的化感物質(zhì)之一,對(duì)生態(tài)有著較好的安全性[22],且使用起來(lái)較方便,可以直接噴灑乳酸進(jìn)入污染水體進(jìn)行銅綠微囊藻的清除.該成果可為富營(yíng)養(yǎng)化水體藍(lán)藻水華治理和抑藻劑的開發(fā)提供有力材料和有用參考.

3　結(jié)論

3.1 乳酸對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)有很強(qiáng)的抑制作用,且抑制效果與乳酸濃度成正相關(guān).

3.2 乳酸可能的抑藻機(jī)理是改變了藻細(xì)胞膜的通透性及其細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu),降低了其抗氧化能力,最終使得藻細(xì)胞裂解死亡.

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The inhibitory effect of lactic acid on Microcystis aeruginosa and its mechanisms.

PENG Gui-ying, CHEN Yong-ling, HAN Yu-zhen, ZHANG Ting-ting*(Collaborative Innovation Center of Recovery and Reconstruction of Degraded Ecosystem in Wanjiang City Belt, College of Life Sciences, Anhui Normal University, Wuhu 241000, China). China Environmental Science, 2016,36(4)：1167～1172

Abstract：The inhibitory effect and possible inhibitory mechanisms of lactic acid on M. aeruginosa were studied. The results showed that lactic acid had a strong inhibiting effect on the growth of M. aeruginosa, 72h, except the inhibition rate of experimental group in lowest concentration was 60%, the rest inhibition rate of experimental group were reached more than 80%; under the stress of lactic acid, the contents of nucleic acid and protein, the electrical conductivity (EC) in M. aeruginosa supernatant all increased, the contents of malondialdehyde (MDA) and oxygen free radical (O2?) of M. aeruginosa cells enhanced, the activity of superoxide dismutase (SOD) decreased, and transmission electron microscope photographs showed that ultrastructure of M. aeruginosa cells had changed obviously. All the results indicated that the possible inhibiting mechanisms were that lactic acid changed the permeability of M. aeruginosa membrane and the cell structure, decreased its antioxidant capacity, and caused the crack and death of the cell in the end.

Key words：lactic acid；Microcystis aeruginosa；inhibitory effect；inhibitory mechanism

作者簡(jiǎn)介：彭桂瑩(1990-),女,安徽東至人,碩士研究生,主要研究方向?yàn)樗蛏鷳B(tài)學(xué).

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31170443)

收稿日期：2015-09-10

中圖分類號(hào)：X503

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-6923(2016)04-1167-06