時偉芳，謝宗銘，楊麗明，王建華，孫 群

(1.中國農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術學院/北京市遺傳改良重點實驗室，北京 100193； 2.新疆農(nóng)墾科學院分子農(nóng)業(yè)技術育種中心，新疆石河子 832000； 3.中國農(nóng)業(yè)大學理學院，北京 100083)

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基于近紅外光譜技術的春小麥單粒種子活力鑒定

時偉芳1，謝宗銘2，楊麗明3，王建華1，孫 群1

(1.中國農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術學院/北京市遺傳改良重點實驗室，北京 100193； 2.新疆農(nóng)墾科學院分子農(nóng)業(yè)技術育種中心，新疆石河子 832000； 3.中國農(nóng)業(yè)大學理學院，北京 100083)

摘要：為研究利用近紅外光譜技術鑒定春小麥單粒種子活力的效果，以2013年收獲的甘肅春小麥品種寧春4號種子為材料，對300粒小麥種子進行近紅外光譜單粒掃描，根據(jù)光譜圖結合發(fā)芽實驗結果建立春小麥種子活力預測模型。結果表明，以腹面和背面平均光譜的建模效果要優(yōu)于單面光譜。最佳建模比例為建模集與檢驗集之比3∶1。應用近紅外光譜定性偏最小二乘分析方法建模，在7 000～8 000 cm-1光譜范圍內采用中心化預處理，在主成分為5時，模型的建模集和檢驗集的鑒別率分別為86.36%和91.30%，建模效果最佳；采用近紅外光譜偏最小二乘法定量檢測小麥種子活力時，建模效果較差。因此，近紅外光譜定性偏最小二乘分析方法適于進行春小麥單粒種子活力定性鑒定。

關鍵詞：春小麥；種子活力；近紅外光譜

近紅外光(NIR)是一種波長介于可見光(VIS)和中紅外光(MIR)的電磁波，波長范圍為780～2 526 nm。近紅外光譜分析技術具有成本低、分析速率快、效率高、適應樣品范圍廣、測試重現(xiàn)性好等優(yōu)點，是典型的無損檢測手段。 20世紀80年代以來，近紅外光譜分析技術伴隨著計算機技術迅速發(fā)展，在農(nóng)產(chǎn)品品質和化學成分的快速檢測方面已有廣泛的應用性研究[1-6]，如小麥籽粒蛋白質、氨基酸含量測定及硬度的快速檢測等[7-9]。在種子活力檢測方面也有研究。如康月瓊等[10]采用傅里葉變換近紅外光譜法建立了水稻、玉米種子生活力的光譜分析模型。另外，該技術還可以對不同老化程度的水稻和玉米種子的活力進行檢測，取得了良好的建模效果[11-12]。Tigabu等[13]將近紅外光譜技術應用到松樹種子活力檢測中，根據(jù)老化與未老化種子內部物質成分構成的不同建立模型，成功區(qū)分了老化與未老化種子。宋樂等[14]開發(fā)了一種基于近紅外光譜的水稻單籽?；盍o損檢測篩選方法。該方法通過近紅外光譜檢測技術檢測水稻種子在活力喪失過程中生化物質的變化，快速無損地檢測區(qū)分高、低活力種子。在一些中藥種子如苦豆子、決明子種子活力檢測中也有研究[15]。但有關該技術在小麥種子活力檢測上的應用性研究報道較少。本研究以春小麥種子為材料，通過近紅外光譜技術運用定性及定量偏最小二乘法進行春小麥單粒種子活力的鑒定，探索近紅外光譜技術用于春小麥種子活力檢測的可行性，以期為春小麥種子活力的快速、無損檢測提供新方法。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗材料為2013年收獲的寧春4號小麥種子，產(chǎn)地甘肅，發(fā)芽率82.7%。該品種為2012年全國推廣面積最大的春小麥品種。

1.2試驗方法

1.2.1光譜采集

將300粒春小麥種子編號，利用德國布魯克儀器公司生產(chǎn)的MPA傅立葉變換近紅外光譜儀掃描種子，設置光譜分辨率為8 cm-1，掃描范圍4 000～12 000 cm-1，掃描次數(shù)32次，掃描方式采用積分球照射。室溫下，將300粒種子依次置于樣品杯中心，掃描小麥種子腹面和背面采集光譜。將采集光譜后的種子依編號擺放整齊，進行垂直玻璃板發(fā)芽實驗。

1.2.2發(fā)芽試驗

首先準備好透明玻璃板，將滅菌后的發(fā)芽紙覆蓋于玻璃板上，小麥種子用1%次氯酸鈉溶液消毒8 min后，每塊玻璃板中上部整齊放置30粒小麥種子，蓋上另1塊玻璃板，兩邊用皮筋繃緊，最后在玻璃板上標明每粒小麥種子的編號。置于發(fā)芽槽中發(fā)芽，發(fā)芽槽加水。第5天記錄每粒種子發(fā)芽情況，并稱取每株幼苗鮮重。

1.2.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用中國農(nóng)業(yè)大學開發(fā)的CAUNIRS軟件進行近紅外光譜分析，利用定性和定量偏最小二乘法分別建立寧春4號小麥種子活力的定量和定性分析模型。將300個種子樣品劃分為建模集和檢驗集。根據(jù)對光譜低頻、合頻和高頻區(qū)的劃分，選擇4 000～5 000 cm-1、4 000～6 000 cm-1、4 000～7 000 cm-1、4 000～8 000 cm-1、4 000～9 000 cm-1、4 000～10 000 cm-1、5 000～6 000 cm-1、5 000～7 000 cm-1、5 000～8 000 cm-1、5 000～9 000 cm-1、5 000～10 000 cm-1、6 000～7 000 cm-1、6 000～8 000 cm-1、6 000～9 000 cm-1、6 000～10 000 cm-1、7 000～8 000 cm-1、7 000～9 000 cm-1、7 000～10 000 cm-1、8 000～9 000 cm-1、8 000～10 000 cm-1、9 000～10 000 cm-1譜區(qū)進行建模。分析過程建模集采用內部交叉驗證方法，比較不同光譜區(qū)范圍內建模集和檢驗集的鑒別率，選擇最合適的光譜范圍。定量分析以檢驗集的決定系數(shù)(R2)、平均相對誤差(AARD)和預測標準差(SEP)評價模型的預測能力和穩(wěn)定性[16]；定性分析以檢驗集鑒別率評價模型預測能力和穩(wěn)定性。

2結果與分析

2.1小麥種子的近紅外光譜特征

圖1 為300粒小麥種子的雙面平均近紅外光譜圖。從光譜圖來看，每粒種子的光譜相似，無法從光譜曲線的差別上判別種子活力。10 000～12 000 cm-1譜區(qū)范圍的光譜普遍存在高頻隨機噪聲的影響，因此，選取4 000～10 000 cm-1波段的光譜進行光譜分析。

2.2小麥種子活力的近紅外光譜定性分析

依據(jù)發(fā)芽實驗結果將種子分成發(fā)芽種子和死種子，分別為260粒和40粒。根據(jù)不同建模比例(建模集和檢驗集種子數(shù)量的比值)下模型的建模集和檢驗集鑒別率選擇最佳建模比例(表1)。腹面單次光譜、背面單次光譜和雙面平均光譜均在建模比例為3∶1時模型鑒別效果最佳，因此選擇在建模比例為3∶1下，數(shù)據(jù)無任何預處理，對小麥種子活力進行定性分析，并根據(jù)模型鑒別率判斷近紅外光譜技術定性分析能否用于種子活力的鑒定。結果(表2)表明，雙面平均光譜的建模結果明顯優(yōu)于腹面單次光譜的建模結果。在5 000～9 000 cm-1、5 000～10 000 cm-1、6 000～8 000 cm-1、7 000～8 000 cm-1、7 000～9 000 cm-1、8 000～9 000 cm-1光譜波段內，雙面平均光譜的模型鑒別率明顯優(yōu)于背面單次光譜鑒別率。在5 000～9 000 cm-1、5 000～10 000 cm-1、8 000～9 000 cm-1光譜波段內，模型建模集和檢驗集的鑒別率分別為84.55%和82.61%；在7 000～8 000 cm-1光譜波段內，主成分為5時，模型的建模集和檢驗集的鑒別率分別為84.85%和91.30%；在7 000～9 000 cm-1光譜波段內，主成分為4時，模型的建模集和檢驗集的鑒別率分別為83.33%和86.96%。綜合考慮各光譜范圍的建模效果，選擇雙面平均光譜在7 000～8 000 cm-1光譜波段作為小麥單粒種子活力建模譜區(qū)。

圖1　春小麥種子的近紅外原始光譜圖

建模比例Ratio腹面單次光譜Ventralgroove主成分Principalcomponent建模集鑒別率Calibration/%檢驗集鑒別率Validation/%背面單次光譜Reverseside主成分Principalcomponent建模集鑒別率Calibration/%檢驗集鑒別率Validation/%雙面平均光譜Bothsides主成分Principalcomponent建模集鑒別率Calibration/%檢驗集鑒別率Validation/%1∶1779.5582.22779.5577.78777.2775.562∶1986.4473.33881.366.67981.3676.673∶1983.3382.611081.8278.26781.8278.263∶2981.1375.00881.9177.11573.5875.004∶1878.8777.78881.6570.37874.6577.787∶31180.6566.67880.6570.37683.8774.07

在7 000～8 000 cm-1和4 000～10 000 cm-1光譜波段內，選用中心化、極差歸一、矢量校正、散射校正、一階導數(shù)、二階導數(shù)等數(shù)據(jù)預處理方法進行建模分析，結果(表3)表明，對比4 000～10 000 cm-1光譜波段，在7 000～8 000 cm-1光譜波段內，各預處理方法對模型的建模集和檢驗集鑒別率均有明顯的提高，可見預處理方法對模型的穩(wěn)定性影響較大。在7 000～8 000 cm-1光譜波段內，若采用中心化預處理方法(表3)，可將模型建模集識別率由84.85%提高到86.36%，但檢驗集識別率沒有提高，依然保持在91.30%。因此，在7 000～8 000 cm-1光譜波段內宜采用中心化預處理方法來改善模型的模擬效果。

2.3小麥種子活力的近紅外光譜定量分析

從300粒種子中剔除未發(fā)芽的40粒種子，選用260粒發(fā)芽種子的光譜進行定量分析，以幼苗鮮重作為建模的化學值。光譜范圍選擇4 000～10 000 cm-1，建模過程采用無預處理、中心化、極差歸一等預處理方式，分析不同預處理方法對小麥種子近紅外模型鑒別率的影響(表4)；表5為無任何預處理下不同光譜區(qū)段對小麥種子近紅外模型預測效果的影響，決定系數(shù)(R2)用來判斷模型的穩(wěn)定性。由表4和表5可見，在各種預處理和4 000～10 000 cm-1光譜波段內，基于幼苗鮮重建立的近紅外光譜模型的建模集和檢驗集的決定系數(shù)普遍太低，甚至出現(xiàn)負值，說明模型擬合效果不佳。因此，基于幼苗鮮重的近紅外光譜技術不適于進行小麥單粒種子活力的定量分析。

表2　光譜區(qū)段對寧春4號近紅外模型預測效果的影響(無預處理 )

表3　不同預處理方法對不同光譜區(qū)段下近紅外模型識別率的影響

表4　不同預處理方法對寧春4號近紅外模型鑒別率的影響

表5　光譜區(qū)段對寧春4號近紅外模型預測效果的影響(無預處理)

3討 論

本研究運用了近紅外光譜分析技術，結合偏最小二乘法分別對單粒小麥種子的活力進行了定性和定量鑒定。結果表明，當建模比例為3∶1時腹面單次光譜、背面單次光譜和雙面平均光譜所建模型建模集和檢驗集的鑒別率均較高，腹面和背面兩次平均光譜的建模效果要優(yōu)于單次光譜，因此以此建模比例和雙面平均光譜進行定性分析最佳。在近紅外光譜與作物種子活力的定性研究中，有近紅外光譜結合BP神經(jīng)網(wǎng)絡技術應用主成分分析(PCA)和離散小波變換法(DWT)智能檢測不同老化程度的玉米種子活力[11]，也有將近紅外光譜技術與主成分-馬氏距離識別法相結合研究經(jīng)劣變處理的燕麥種子的活力差異等[17]。此外，近紅外光譜技術在水稻種子、決明子和苦豆子等種子活力檢測中也均有應用性研究[18]。本試驗利用近紅外光譜技術，通過對不同光譜范圍區(qū)段和不同預處理方法下建模集和檢驗集的鑒別率比較發(fā)現(xiàn)，在光譜范圍為7 000～8 000 cm-1，采用中心化預處理方法，主成分為5時，模型的建模集和檢驗集的鑒別率分別為86.36%和91.30%，建模效果最優(yōu)，說明近紅外偏最小二乘分析方法可用于單粒小麥種子活力的定性鑒定。

應用近紅外偏最小二乘定量分析單粒小麥的活力時，不同光譜區(qū)段和預處理方法下所建模型的決定系數(shù)(R2)均在0.2以下，說明近紅外定量分析技術在鑒定小麥單粒種子活力上效果欠佳?？赡苁且驗樾←湻N子在其生產(chǎn)及后期發(fā)芽實驗過程中，由于受其自身發(fā)育情況及培養(yǎng)環(huán)境的影響，小麥種子活力不能完全由幼苗鮮重大小來衡量，加上表現(xiàn)不同活力程度小麥種子的幼苗鮮重差異較小，各單粒小麥種子的掃描光譜也極為相似，因此與近紅外光譜結合來鑒定小麥種子活力存在一定的局限性，該技術應用于單粒種子活力的定量檢測還有待于進一步研究。

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Identification of Single Seed Vigor of Spring Wheat Based on Near-Infrared Spectroscopy

SHI Weifang1,XIE Zongming2,YANG Liming3,WANG Jianhua1,SUN Qun1

(1.Beijing Key Laboratory of Crop Genetic Improvement,China Agricultural University,Beijing 100193,China;2.Center for Molecular Agro-biotechnology and Breeding,Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science,Shihezi,Xinjiang 832000,China; 3.College of Science,China Agricultural University,Beijing 100083,China)

Abstract:To optimize the identification of single seed vigor by near infrared spectroscopy,Ningchun 4 seeds harvested in Gansu in 2013 were selected as sample. Spectrums of 300 single seeds were collected by Fourier near-infrared spectrometer,combing with the results of the germination experiments. The results showed that the modeling based on the average spectrum at both sides was better than that based on single side of one seed. The best ratio between calibration and validation sets was 3∶1. By using distinguished partial least squares (DPLS) and centralized pretreatment method,the best modeling performed that the identification rates of the calibration and validation sets were 86.36% and 91.30% with the spectrum range from 7 000 cm-1to 8 000 cm-1and the main component was 5,respectively.The quantitative partial least squares (QPLS) modeling based on fresh weight could not be used for seed vigor analysis. DPLS based on Near-infrared spectroscopy is suitable to analyse the single seed vigor of spring wheat.

Key words:Spring wheat; Seed vigor; Near-infrared spectroscopy

中圖分類號：S512.1；S311

文獻標識碼：A

文章編號：1009-1041(2016)02-0200-06

通訊作者：孫 群(E-mail:sunqun@cau.edu.cn)

基金項目：農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303002)；新疆生產(chǎn)建設兵團“十二五”項目(2012BD046)

收稿日期：2015-08-31修回日期：2015-10-14

網(wǎng)絡出版時間：2016-01-26

網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160126.1945.018.html

第一作者E-mail：shiweifang618@foxmail.com