劉　波，丁利靜，李　菲，龔其海

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室暨基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義　563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 藥劑科，貴州 遵義　563099)

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基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

天麻素對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

劉波1，丁利靜2，李菲1，龔其海1

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室暨基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 藥劑科，貴州 遵義563099)

[摘要]目的 觀察天麻素對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織中缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等基因mRNA表達(dá)的影響。方法 灌胃不同劑量天麻素7 d，采用線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈局灶性腦缺血(2 h)再灌注損傷模型，造模成功后繼續(xù)給藥7 d。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real Time RT-PCR)法檢測缺血半暗帶腦組織中HIF-1α、VEGF、BDNF、MMP2、eNOS、PPARα 及SOD1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果 天麻素可上調(diào)HIF-1α、VEGF、BDNF、MMP2、eNOS、PPARα、SOD1 mRNA的表達(dá)(P<0.05)，下調(diào)MMP2 mRNA的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論 天麻素可通過上調(diào)大鼠腦缺血半暗帶HIF-1α、VEGF、BDNF、MMP2、eNOS、PPARα、SOD1 mRNA的表達(dá)，下調(diào)MMP2 mRNA的表達(dá)，產(chǎn)生抗局灶性腦缺血再灌注損傷的作用。

[關(guān)鍵詞]天麻素；腦缺血再灌注；神經(jīng)保護(hù)；大鼠；mRNA

腦缺血具有較高的發(fā)病率、致殘率、死亡率及復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)，因腦卒中而死亡的人數(shù)位居全球第3位，且呈逐年上升趨勢(shì)[1]。腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury, I/R)是腦缺血發(fā)病的重要病理生理環(huán)節(jié)，其病理生理學(xué)機(jī)制十分復(fù)雜，抑制I/R是降低腦缺血死亡率和致殘率的關(guān)鍵。然而，迄今為止，在治療學(xué)上尚無理想的治療I/R的藥物。故探索新的神經(jīng)保護(hù)劑具有重要意義。天麻為貴州省道地藥材，具有“息風(fēng)止痙，平肝潛陽，祛風(fēng)通絡(luò)”等功效。天麻素(Gastrodine，Gas)是天麻的主要活性成分之一，現(xiàn)在藥理學(xué)研究表明天麻素能夠通過血腦屏障，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用較為活躍，具有治療心腦血管疾病、頭痛、眩暈、癲癇和肌強(qiáng)直等作用[2-3]。既往實(shí)驗(yàn)研究顯示天麻素可以通過抑制γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)降解酶、GABAA受體活性、抗炎、抗氧化、抑制凋亡等機(jī)制改善中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)所致局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)功能、明顯縮小梗死面積并降低腦含水量，對(duì)大鼠I/R有顯著的保護(hù)作用[4-6]，但其保護(hù)機(jī)制尚不完全明了。因此，本研究擬在大鼠急性局灶性I/R損傷模型基礎(chǔ)上，探討天麻素對(duì)腦缺血半暗帶缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2 (matrix metalloproteinase-2,MMP2)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferators activated receptors,PPARα)、超氧化物岐化酶-1(superoxide dismutase-1，SOD1)mRNA表達(dá)的影響，旨在進(jìn)一步探索天麻素保護(hù)I/R的機(jī)制，為臨床治療腦缺血性疾病提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)試劑天麻素(Gas)，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，純度≥98%；尼莫地平，山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)賽特有限責(zé)任公司；MCAO栓線，北京沙東生物技術(shù)有限公司；轉(zhuǎn)錄試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司；GAPDH、HIF-1α、VEGF、BDNF、MMP2、eNOS、PPARα、SOD1 mRNA引物，寶生物工程(大連)有限公司；其它均為市售分析純產(chǎn)品。

1.2儀器實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國BIO-RAD公司；逆轉(zhuǎn)錄儀，德國Eppendorf公司。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)SD大鼠90只，雄性，體重250～280 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)：SCXK(渝)2007-0005]。光照/暗時(shí)間為12 h/12 h循環(huán)，自由飲食、飲水。

1.4方法

1.4.1實(shí)驗(yàn)分組大鼠分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為6組，分別為假手術(shù)組(Sham)、模型組(Model)、Gas低、中、高劑量(記為Gas-L、Gas-M、Gas-H，劑量分別為15、30、60 mg/kg)組、陽性藥組(Nim，12 mg/kg)，每組15只。分組前預(yù)防性灌胃給藥7 d，假手術(shù)組、模型組給予等體積的雙蒸水，制模成功后繼續(xù)灌胃給藥1周。動(dòng)物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)過程均遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與保護(hù)準(zhǔn)則。

1.4.2大鼠腦缺血再灌注模型的制備7%的水合氯醛(0.5 mL/100g)腹腔注射麻醉，固定，參照Longa等[7]的方法，并加以改進(jìn)制備大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞模型[8]。分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈。MCAO栓線圓頭端從頸總動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈 18～20 mm，感到阻力即表明栓線圓頭已到達(dá)大腦中動(dòng)脈起始端。2 h后，外拉栓線，實(shí)現(xiàn)大腦中動(dòng)脈血液再灌。假手術(shù)組只結(jié)扎血管，不插栓線。

1.4.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real Time RT-PCR)檢測腦缺血半暗帶組織中HIF-1α、VEGF、BDNF、MMP2、eNOS、PPARα及SOD1 mRNA的表達(dá)每組取6只大鼠按試劑盒說明進(jìn)行大鼠腦缺血半暗帶RNA的提取，紫外分光光度計(jì)測量260、280 nm處吸光度(A)值，其A260/A280值為1.8～2.0。采用TaKaRa公司的RT試劑盒，在Eppend of Mastercycler Gradient PCR儀逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以GAPDH作為內(nèi)參基因，通過iCycler iQ real-time PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列(見表1)。以Ct值為統(tǒng)計(jì)參數(shù)依次計(jì)算下列數(shù)據(jù)：①Ctaverage=(Ct1+Ct2+Ct3)/3(重復(fù)管)，②dCt=Ctaverage-中間值，③基因的表達(dá)=2^(-dCt)，④以目的基因的表達(dá)/內(nèi)參基因的表達(dá)進(jìn)行HIF-1α、VEGF、BDNF、MMP2、eNOS、PPARα及SOD1mRNA的相對(duì)定量。

表1引物序列

基因上游引物(5'-3')下游引物(5'-3')HIF-1αCCAGATTCAAGATCAGCCAGCAGCTGTCCACATCAAAGCAGTACTCAVEGFGCCCATGAAGTGGTGAAGTTCAGATGTCCACCAGGGTCTCAABDNFGAAGGGCCAGGTCGATTAGGTGGACGGAAACAGAACGAACAGAAACAGMMP2CCAAGAACTTCCGACTATCCAATGACAGTGTAGGCGTGGGTCCAGTAeNOSAGATCCATGCAGACAGCCACAGAGGCTGGTACATGAGTTCAGAPPARαCTGACATTTGTGACTGGTCAAGCTCTTTCCAGGTCATCTGCTTCAAGTGSOD1AATGTGTCCATTGAAGATCGTGTGAGCTTCCAGCATTTCCAGTCTTTGTAGAPDHTAACCAGGCGTCCBATACGCAGTGCCAGCCTCGTCTCA

2結(jié)果

2.1Gas對(duì)MCAO大鼠腦組織HIF-1α、VEGF、BDNFmRNA表達(dá)的影響每組隨機(jī)抽取6只大鼠缺血半暗帶腦組織，Real Time RT-PCR法測定相關(guān)基因的mRNA表達(dá)。與假手術(shù)組相比，模型組HIF-1αmRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05)。與模型組相比，天麻素給藥組HIF-1α、VEGF、BDNFmRNA的表達(dá)明顯增加(P<0.05，見表2)。

2.2Gas對(duì)MCAO大鼠腦組織MMP2、eNOS、PPARα和SOD1 mRNA表達(dá)的影響每組隨機(jī)抽取6只大鼠缺血半暗帶腦組織，Real Time RT-PCR法測定相關(guān)基因的mRNA表達(dá)。與假手術(shù)組相比，模型組MMP2、eNOS、PPARαmRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05)，SOD1 mRNA表達(dá)明顯減少(P<0.01)。與模型組相比，天麻素給藥組eNOS、PPARα、SOD1 mRNA的表達(dá)明顯增加(P<0.05)，天麻素高劑量給藥組MMP2 mRNA的表達(dá)明顯降低(P<0.05，見表2)。

處理HIF-1αVEGFBDNFMMP2eNOS PPARαSOD1Sham100±4100±43100±29100±22100±25100±37100±12 Model572±20##122±37106±31648±157##216±52##231±70#52±23##Nim765±27133±59109±40309±65*379±69*351±14*165±18**Gas-L930±41*202±63*119±33518±92690±179**633±78*95±21*Gas-M907±40*260±68*286±61*293±121426±12*1283±357* 366±110*Gas-H741±17*202±38*308±13*278±90*430±23*464±110*680±110*

##：與假手術(shù)組比，P<0.01;*：與模型組比，P<0.05；**：與模型組比，P<0.01。

3討論

I/R后，由于缺血、缺氧引起神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死、 凋亡，導(dǎo)致神經(jīng)功能受損。因此，改善缺血腦組織缺血、缺氧狀態(tài)，是治療腦缺血的有效方法之一[9-10]。

HIF-1α是大腦缺氧時(shí)機(jī)體產(chǎn)生的一種重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，對(duì)腦缺血后神經(jīng)元的存活、凋亡及血管生成的調(diào)控產(chǎn)生重要作用。缺氧狀態(tài)下，HIF-1α能通過調(diào)節(jié)各種靶基因的表達(dá)產(chǎn)生對(duì)缺氧的適應(yīng)性反應(yīng)，使缺氧的神經(jīng)細(xì)胞保持一定的氧濃度，并誘導(dǎo)腦缺血耐受的形成，從而達(dá)到保護(hù)神經(jīng)的作用[11-12]。VEGF、BDNF是HIF-1α眾多靶基因中的2種重要的基因，其編碼的蛋白參與血管新生與重塑、神經(jīng)再生等過程[13]。VEGF是主要的調(diào)控血管生成的因子，它與內(nèi)皮細(xì)胞VEGF受體相結(jié)合，在血管新生的早期發(fā)揮關(guān)鍵性作用，是整個(gè)腦缺血后血管新生調(diào)控的中心環(huán)節(jié)[14]。BDNF在腦組織中分布廣泛，在病理狀態(tài)下，它能減輕神經(jīng)元的病理損傷、促進(jìn)受損傷神經(jīng)元再生、分化等。以往研究表明預(yù)防性給予BDNF可抑制Caspase-3激活，阻止缺血缺氧所引起的細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[15]。本研究表明，Gas減輕腦缺血再灌注損傷可能與上調(diào)HIF-1α/VEGF/BDNF的基因表達(dá)有關(guān)。

PPARα在外周和腦內(nèi)分布相當(dāng)廣泛[16]。PPARα受體激動(dòng)劑可進(jìn)一步抑制NF-κB的活性，具有抗氧化應(yīng)激及抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的作用[17-18]。I/R后會(huì)引起血腦屏障功能損害，血管通透性發(fā)生改變，使腦水腫癥狀明顯。研究表明MMPs抑制劑能顯著減輕缺血再灌注損傷后血腦屏障破壞及腦水腫的程度，同時(shí)，抑制慢性腦低灌注大鼠腦組織MMP2的表達(dá)，可保護(hù)血腦屏障，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[19]。本研究表明，Gas能夠上調(diào)PPARαmRNA的表達(dá)，同時(shí)，腦缺血再灌注損傷伴有MMP2 mRNA的高表達(dá)，而Gas可以通過抑制其高表達(dá)，從而起到保護(hù)缺血缺氧腦組織的作用。

eNOS及其產(chǎn)物對(duì)維持大腦血液供應(yīng)和保護(hù)神經(jīng)元起著重要作用。在eNOS敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠MCAO 模型中，可觀察到其缺血區(qū)域的血液供應(yīng)減少，腦梗死體積較野生型小鼠明顯增加[20-21]。同時(shí)，自由基損傷也是腦缺血再灌注中重要的機(jī)制，Gas可以通過上調(diào)SOD等抗氧化酶治療AD等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[22]。本研究結(jié)果與報(bào)道一致。

腦缺血再灌注后，模型組HIF-1α、eNOS、PPARαmRNA表達(dá)明顯上調(diào)[11]，可能與機(jī)體自身修復(fù)機(jī)制有關(guān)。再灌注損傷常伴有MMP2的高表達(dá)[23]，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生諸多氧自由基，內(nèi)源性自由基清除劑SOD1也將大量消耗[24]。本研究支持既往研究結(jié)果。

綜上所述，Gas可通過促進(jìn)HIF-1α、VEGF、BDNF、eNOS、PPARα及SOD1mRNA表達(dá)，抑制MMP2的釋放發(fā)揮抗腦缺血再灌注損傷的作用。本研究從基因轉(zhuǎn)錄水平研究了Gas抗I/R的作用，為后續(xù)闡明其深入作用機(jī)制提供了重要線索。

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[收稿2016-01-07;修回2016-03-04]

(編輯：王靜)

Effect of Gastrodin on related genes mRNA expressions in cerebral ischemia-reperfusion rats

LiuBo1,DingLijing2,LiFei1,GongQihai1

(1.Department of Pharmacology and Key Laboratory of Basic Pharamacology of Ministry of Education, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 2.Department of Pharmacy,Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective To explore the effects of Gastrodin (Gas) on the mRNA expressions of hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α), vascular endothelial growth factor (VEGF) and other genes in the ischemic penumbra of rats injured by ischemia (2 h)-reperfusion (I/R). Methods Rats were pretreated with Gas for 7 days followed by the focal cerebral I/R and then Gas was withdrawn 7 days after the I/R surgery. The mRNA expressions of HIF-1α, VEGF, brain derived neurotrophic factor (BDNF), matrix metalloproteinase-2 (MMP2), endothelial nitric oxide synthase (eNOS), peroxisome proliferators activated receptors (PPARα) and superoxide dismutase-1 (SOD1) in the ischemic penumbra of rats were detected by Real Time RT-PCR.Results The expressions of HIF-1α, VEGF, BDNF, MMP2, eNOS, PPARα and SOD1 mRNA in Gas group increased obviously (P<0.05), while the expression of MMP2 mRNA in Gas group decreased obviously (P<0.05).Conclusion Gas has protective effects on I/R-injured rat brain by up-regulating the expressions of HIF-1α, VEGF, BDNF, eNOS, PPARα and SOD1 and down-regulating the expression of MMP2.

[Key words]Gastrodin; cerebral ischemia-reperfusion; neuroprotection; rat; mRNA

[中圖法分類號(hào)]R972

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1000-2715(2016)02-0139-04

[通信作者]龔其海，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)，E-mail:gqh@zmc.edu.cn。

[基金項(xiàng)目]貴州省社會(huì)攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(NO：黔科合SY字20083040)；貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(NO：黔科合JZ字[2014]2015)。