毛吾蘭·買買提依明， 張盼盼， 劉鳳霞, 阿地力江·伊明, 木薩·艾麥爾, 薛志琴, 陳勝國(guó)

(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1生物學(xué)教研室， 2人體解剖學(xué)教研室， 烏魯木齊　830011)

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維醫(yī)異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證大鼠模型陰莖組織中ET-1的改變及其生物學(xué)意義

毛吾蘭·買買提依明1， 張盼盼2， 劉鳳霞2, 阿地力江·伊明2, 木薩·艾麥爾2, 薛志琴2, 陳勝國(guó)2

(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1生物學(xué)教研室，2人體解剖學(xué)教研室， 烏魯木齊830011)

摘要：目的研究維醫(yī)異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證大鼠模型陰莖組織中ET-1的改變及其生物學(xué)意義。方法100只SD大鼠經(jīng)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)具有正常性功能后，10只作為正常對(duì)照組，其余90只作為造模組，采用濕寒性飼料和濕寒性環(huán)境條件下建立異常黏液質(zhì)證候模型。造模20 w以后，通過(guò)交配和勃起實(shí)驗(yàn)從證候模型中篩選出陽(yáng)痿病證模型，并將其分為病證模型組和病證藥物反證組，未成陽(yáng)痿的證候模型再隨機(jī)分為證候模型組與證候藥物反證組。藥物干預(yù)2周后，取材，并對(duì)陰莖組織進(jìn)行免疫組化染色，光鏡下觀察。 結(jié)果證候模型組、病證模型組大鼠陰莖組織中ET-1的表達(dá)均較正常對(duì)照組顯著增高(P<0.05)，各組織間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而證候藥物反證組和病證藥物反證組ET-1較證候模型組和病證模型組明顯降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論ET-1表達(dá)水平升高可能是異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證重要的發(fā)病機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：異常黏液質(zhì)； 勃起功能障礙； 內(nèi)皮素-1

勃起功能障礙(erectile dysfunction,ED)是指在近6個(gè)月陰莖不能勃起或勃起不堅(jiān)從而導(dǎo)致性生活不滿意的一種病理現(xiàn)象[1]，為最常見(jiàn)的男性性功能障礙疾病，屬于維吾爾醫(yī)學(xué)優(yōu)勢(shì)病種[2]。本課題組依據(jù)維吾爾醫(yī)學(xué)(維醫(yī))體液學(xué)說(shuō)，采用濕寒飼料結(jié)合濕寒環(huán)境條件成功建立了異常黏液質(zhì)證候大鼠模型，并在此基礎(chǔ)上篩選出異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證模型大鼠[3-4]。本研究通過(guò)對(duì)異常黏液質(zhì)陽(yáng)痿病證大鼠陰莖組織中的ET-1表達(dá)水平的變化，進(jìn)一步探討異常黏液質(zhì)陽(yáng)痿病證的發(fā)生和發(fā)展與ET-1表達(dá)的關(guān)系。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的雄性清潔級(jí)SD大鼠100只和雌性大鼠20只，體質(zhì)量(230±20)g。

1.2儀器和試劑BIC-400型人工氣候箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，萊卡2135型切片機(jī)(德國(guó)萊卡)。阿撲嗎啡(美國(guó)Sigma公司)，伊木薩克片(新疆和田維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20130501)。

1.3動(dòng)物模型的建立

1.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備將經(jīng)過(guò)交配實(shí)驗(yàn)和勃起實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有正常性功能的100只雄性SD大鼠中隨機(jī)抽取10只作為正常對(duì)照組(正常組)，其余90只SD大鼠作為造模組，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)，大鼠自由飲食，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(22±2)℃，濕度為(55±5)%。

1.3.2飼料的制備濕寒性質(zhì)的飼料由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心制備，以每千克常規(guī)飼料中分別加入150 g芫荽實(shí)和菠菜實(shí)制成濕寒性特殊飼料 。芫荽實(shí)和菠菜由新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院提供。

1.3.3異常黏液質(zhì)證侯與陽(yáng)痿病證大鼠模型的建立及分組正常組用常規(guī)方法飼養(yǎng)，每日提供500 g普通飼料、1 000 mL水、200 g墊料。造模組以10:00～20:00/22:00～10:00為時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)分2個(gè)時(shí)間段交替放入溫度為(8±2)℃ 、濕度為(85±5)%的人工氣候箱中，每日給予500 g濕寒性飼料，水與墊料同上。造模組與正常組均隨機(jī)飲食水，以12 h為周期模擬晝夜給予人工照明。造模開始20 w后，通過(guò)交配實(shí)驗(yàn)和APO勃起實(shí)驗(yàn)篩選出陽(yáng)痿病證模型，將其再隨機(jī)分為病證模型組和病證藥物反證組。未成陽(yáng)痿者為證候模型，再將其隨機(jī)分為證候模型組和證候藥物反證組。

1.3.4藥物干預(yù)將藥物干預(yù)組大鼠予以對(duì)證藥物伊木薩克片每日灌胃1次(250 mg/kg體質(zhì)量)，其余各組使用等劑量蒸餾水灌胃，干預(yù)2 w。期間記錄各項(xiàng)生物學(xué)表征，進(jìn)行APO勃起實(shí)驗(yàn)和交配實(shí)驗(yàn)。

1.3.5標(biāo)本采集與制備干預(yù)期結(jié)束后，腹腔注射大鼠用1% 戊巴比妥鈉溶液(40 mg/kg體質(zhì)量)麻醉大鼠，取下陰莖組織，經(jīng)10% 甲醛溶液固定48 h后，進(jìn)行石蠟包埋并制成石蠟切片。

1.3.6免疫組化染色采用SP法免疫組化染色檢測(cè)ET-1在陰莖組織中的表達(dá)。在顯微鏡下(放大倍數(shù)400倍)計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，并按陽(yáng)性范圍和著色強(qiáng)度的乘積進(jìn)行評(píng)分。

2結(jié)果

ET-1在大鼠陰莖海綿體竇壁及動(dòng)脈周圍的細(xì)胞胞核和胞漿中均有表達(dá)。棕黃色胞核及淡黃色胞漿為陽(yáng)性細(xì)胞，藍(lán)色胞核及無(wú)色胞漿為陰性細(xì)胞。與正常組相比，病證模型組及證候模型組大鼠陰莖組織中ET-1的表達(dá)顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，證候藥物反證組和病證藥物反證組較證侯模型組和病證模型組明顯降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1、圖1)。

表1　各組大鼠陰莖組織中ET-1的表達(dá)水平(±s， 分)

注： 與正常對(duì)照組比較,*P<0.05。

3討論

陰莖勃起是神經(jīng)及內(nèi)分泌凋節(jié)下的一系列復(fù)雜的神經(jīng)、血管活動(dòng)，需要有正常的血管內(nèi)皮細(xì)胞和陰莖海綿體組織參與。內(nèi)皮素(endothelin，ET)是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的血管收縮因子之一，主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，具有收縮血管、促進(jìn)血管平滑肌增生的作用，而且能介導(dǎo)各種平滑肌包括陰莖海綿體、尿道海綿體平滑肌收縮， 是反映血管內(nèi)皮功能的最有力的指標(biāo)之一[5-6]。眾多研究已表明，ED患者體內(nèi)ET-1濃度高于正常男性，而且在陰莖組織中ET-1的作用存在計(jì)量依賴性，小劑量時(shí)具有血管舒張效應(yīng)，而大劑量時(shí)具有血管收縮效應(yīng)[7]。對(duì)于絕大多數(shù)病人來(lái)說(shuō)，ED并不是一個(gè)臨時(shí)的癥狀，而是同高血壓、糖尿病一樣是一種慢性疾病。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)ET-I在勃起功能障礙的發(fā)生發(fā)展中亦起到一定作用[8]。血管內(nèi)皮功能和海綿體平滑肌細(xì)胞功能損害，是ED最常見(jiàn)的病因。血管內(nèi)皮功能異常、ET-1水平增高在ED的病理生理機(jī)制中起著重要的作用，因此應(yīng)用藥物改善血管內(nèi)皮功能、拮抗ET-1的作用對(duì)改善ED具有一定的臨床意義。Nagla等[9]研究報(bào)道，ED患者的陰莖海綿體血管中ET-1的濃度顯著高于正常人，并且證實(shí)了ET-1可以作為ED所導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的臨床標(biāo)記。

N： 正常對(duì)照組； A1： 病證模型組； A4： 病證藥物反證組; B1： 證候模型組； B3： 證候藥物反證組

本課題組前期研究在建立異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證大鼠模型基礎(chǔ)上[10-11 ]，研究了NO-cGMP通路的改變，并由此得出NO-cGMP通路的改變是該病證發(fā)生、發(fā)展核心機(jī)制之一[ 12]。但是，陽(yáng)痿是由神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)下的一系列血管平滑肌舒張反應(yīng),其中血管內(nèi)皮功能發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。故本研究在建立異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證大鼠基礎(chǔ)上，通過(guò)免疫組化法對(duì)ET-1在陰莖組織中的含量進(jìn)行了檢測(cè)并探討其在異常黏液質(zhì)型陽(yáng)痿病證的發(fā)生、發(fā)展中可能的機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，在異常黏液質(zhì)陽(yáng)痿大鼠陰莖組織中ET-1的表達(dá)水平顯著增高，提示該病證大鼠模型中由于血管內(nèi)皮功能的改變，導(dǎo)致ET-1升高可能是其重要發(fā)病機(jī)制之一，并參與了該病證的發(fā)生、發(fā)展中，可能是血管內(nèi)功能損傷后導(dǎo)致ET-1含量的升高，進(jìn)而導(dǎo)致增強(qiáng)了血管的收縮效應(yīng)所致。而經(jīng)對(duì)證藥物伊木薩克片干預(yù)之后，雖得到明顯下調(diào)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示ET-1可能并非是該藥的作用靶點(diǎn)，而是通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌功能和激活NO-cGMP通路等其他途徑而實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，ET-1做為重要的血管收縮因子，其含量顯著升高是異常黏液質(zhì)型陽(yáng)瘺病證的重要機(jī)制之一，同時(shí)，本研究亦提示，ET-1可能不是維藥伊木薩克片的作用靶點(diǎn)之一。至于ET-1在該病證發(fā)生、發(fā)展中的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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(本文編輯周芳)

Biological significance and variation of endothelin-1 in the penis of rat model with abnormal phlegmatic syndrome

Maowulan Maimaitiyiming1, ZHANG Panpan2, LIU Fengxia2, Adilijiang Yiming2, Musa Aimaier2,XUE Zhiqin2, CHEN Shengguo2

(1DepartmentofBiology,2DepartmentofHumanAnatomy,CollegeofBasicMedicine,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract:ObjectiveTo study the biological significance and variation of endothelin-1 expression in the penis of rat model with impotence disease. MethodsA total of 100 normal mature male SD rats were enrolled in the study，and 10 of them were randomly chosen as the control group，the other 90 were treated with spinach and coriander diet in a cold and humid environment until the model of abnormal phlegmatic syndrome was established．After 20 weeks of diet treatment, they were divided into abnormal phlegmatic syndrome model group and pharmacological intervention group by APO erectile experiments and mating experiments. After 2 weeks of recovery treatment to the pharmacological intervention group, immunohistochemical stainingwas conducted in the penile tissue of all groups. ResultsCompared withthe control group, the level of endothelin-1 expression in the impotence model group, medication group of impotence model , abnormal balgam syndrome group was increased significantly (P<0.05). Each of group have no obvious difference (P>0.05). After medication intervention, the level of endothelin-1 in medication group of abnormal balgam syndrome and medication group of impotence model were both decreased significantly. ConclusionThe level of endothelin-1 expression on abnormal mucinous impotence disease syndrome of rats increased significantly.

Keywords:abnormal balgam syndrome; erectile dysfunction; endothelin-1

[收稿日期：2016-03-06]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.05.003

中圖分類號(hào)：R291.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-5551(2016)05-0535-03

作者簡(jiǎn)介：毛吾蘭·買買提依明(1972-)，男(維吾爾族)，博士，研究方向：生殖健康的中維西醫(yī)結(jié)合研究。通信作者：阿地力江·伊明，男(維吾爾族)，博士, 教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：生殖健康的中維西醫(yī)結(jié)合研究， E-mail：adljym@163.com。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81160470)