李夢婕　謝津　李向楠　陳玉惠

(西南林業(yè)大學，昆明，650224)

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石楠銹孢銹菌重寄生現(xiàn)象及其重寄生菌的種類鑒定1)

李夢婕謝津李向楠陳玉惠

(西南林業(yè)大學，昆明，650224)

摘要研究了昆明地區(qū)石楠銹孢銹菌(Aecidium pourthiaea)上的重寄生現(xiàn)象并對重寄生菌進行了分離、回接驗證和鑒定。結果顯示：石楠銹孢銹上的重寄生菌在7月底逐漸發(fā)生，其自然重寄生率從10月中旬開始快速增長，12月中旬達到高峰。石楠銹孢銹的重寄生菌包括鏈格孢屬(Alternaria spp.)、擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis spp.)、枝孢屬(Cladosporium spp.)、鐮刀菌屬(Fusarium spp.)、木霉屬(Trichoderma sp.)的真菌及粉紅單端孢(Trichothecium roseum)等多種，其中重寄生效果及對銹菌寄主植物安全性最好的菌株為擬盤多毛孢屬的SYP22菌株和枝孢屬的SYC23菌株。

關鍵詞石楠銹孢銹菌；重寄生菌；人工培養(yǎng)

分類號S763.11;Q939.95

Hyperparasitism onAecidiumpourthiaeaand Species Identification of the Mycoparasite//

Li Mengjie, Xie Jin, Li Xiangnan, Chen Yuhui

(Southwest Forestry University, Kunming 650224, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(5)：92-96.

We observed the hyperparasitism of mycoparasite onAecidiumpourthiaeain Kunming, and isolated and identified the mycoparasite. The mycoparasites onAecidiumpourthiaeaappeared on the aecium ofAecidiumpourthiaeasince the end of July, were rapidly increased from the middle of October, and reached a peak in the middle of December. The various mycoparasite onAecidiumpourthiaeamainly includedAlternariaspp.,Pestalotiopsisspp.,Cladosporiumspp.,Fusariumspp.,Trichodermasp., andTrichotheciumroseum, and SYP22 (a strain ofPestalotiopsis) and SYC23 (a strain ofCladosporium) had better hyperparasitism effect and better safety to plant compared to other mycoparasites.

KeywordsAecidium pourthiaea； Mycoparasite； Artificial rearing

石楠銹孢銹菌(Aecidiumpourthiaea)是石楠(Photiniaprionophylla)銹病的病原菌，主要危害3年生以下幼樹及幼苗，引起葉、腋芽和梢壞死，嚴重影響石楠的正常生長及觀賞價值[1]。重寄生菌在植物病害生物防治中是非常重要的菌種資源，已經(jīng)越來越受到各國植物病理學家的重視。筆者在進行銹菌重寄生菌調查時發(fā)現(xiàn)，在石楠銹孢銹的銹子器上有明顯的多種重寄生現(xiàn)象，且對石楠銹孢銹的銹子器和銹孢子具有顯著的破壞作用。關于銹菌的重寄生現(xiàn)象及重寄生菌已有較多報道，目前已發(fā)現(xiàn)的能夠被重寄生的銹菌有茶藨生柱銹(Cronartiumribicola)[2-3]、梨膠銹菌(Gymnosporangiumasiaticum)[4]、落葉松擬三胞銹菌(Triphragmiopsislaricinum)[5-6]、楊柴銹病菌(Uromyceshedysari-mongolici)[7]、黃柏鞘銹菌(Coleosporiumphellodendri)[8]和松芍柱銹菌(Cronartiumflaccidum)[9]等，但至今未見對石楠銹孢銹菌重寄生菌的報道。本研究對重寄生菌在石楠銹孢銹菌的寄生現(xiàn)象及其發(fā)生特點進行了研究，并對重寄生菌進行了分離及種類鑒定，以期為石楠銹病的生物防治提供理論參考和菌種資源。

1材料與方法

1.1重寄生菌的寄生情況調查

于2014年7—12月，每隔15 d在西南林業(yè)大學一樣地內隨機抽取已有石楠銹孢銹菌銹子器的石楠病葉100片，觀察記錄重寄生菌寄生銹菌的現(xiàn)象。重寄生率=(被寄生葉片數(shù)/總葉片數(shù))×100%。

1.2材料采集

于2013年和2014年的9月上旬至11月下旬，在西南林業(yè)大學石楠種植區(qū)設置3個樣點，分6次在各樣點隨機選取5株感病石楠采集葉片，每株取樣數(shù)不低于5份。取樣時選取肉眼可見有重寄生現(xiàn)象發(fā)生的葉片，整片采下裝入干凈的塑料袋內帶回實驗室備用。

1.3菌株分離、純化及鑒定

采用2種方法從被重寄生菌寄生的石楠病葉部位分離重寄生菌。方法一：以PDA為培養(yǎng)基，采用組織分離法進行分離[10]。方法二：將供試材料置于室溫下保濕，待銹子器表面長出菌絲體后，用滅菌的接種針挑取少量菌絲體接種至PDA平板，(25±2)℃培養(yǎng)，待平板上長出菌落后做進一步純化。待全部菌株純化后，觀察記錄各菌株的培養(yǎng)性狀；菌落產(chǎn)孢后，于顯微鏡下觀察、記錄各菌株的產(chǎn)孢特征、孢子形態(tài)及大小，查閱相關文獻確定其分類地位，并將其歸類到屬。

1.4重寄生菌的回接驗證

供試菌株和病葉：從已分離純化的菌株中挑取20個菌株作為供試菌株。菌株號分別為：SYA03、SYA34、SYA65、SYP01、SYP03、SYP08、SYP16、SYP22、SYP27、SYC02、SYC06、SYC17、SYC23、SYC24、SYC45、SYF02、SYF05、SYT01、SYTr12和SYW21。供試病葉為已產(chǎn)明顯銹子器和銹孢子但未被重寄生菌寄生的石楠病葉。

重寄生菌的確定：參照楊艷紅的方法[2]。將放有濾紙的培養(yǎng)皿高溫滅菌，在無菌條件下滴入少量無菌水浸潤濾紙，然后將用75%乙醇表面消毒后的供試葉片著生銹子器面向上置于濾紙上，再將直徑約5 mm的供試菌株菌塊接種至銹子器上，每處理設3組重復。以不接供試菌的石楠病葉為對照1，以直接將菌塊置于濕潤濾紙上培養(yǎng)為對照2，(25±2)℃培養(yǎng)，3 d后觀察并記錄結果。

供試菌株對接種銹孢子的影響：挑取少量接種后的銹子器制成水片，于顯微鏡下觀察其內銹孢子的變化情況。采用臺盼藍染色檢測銹孢子活力，根據(jù)銹孢子著色情況計算銹孢子的死亡率。設銹孢子完好且孢子內含物未被染成藍色為有活力者，反之則為死亡孢子。銹孢子死亡率=(死亡銹孢子數(shù)/視野內銹孢子總數(shù))×100%。

重寄生菌的再分離：挑取“重寄生菌的確定”中各處理銹子器上生長的菌絲置于PDA平板上，(25±2)℃培養(yǎng)，待長出菌落后做進一步純化，并與原供試菌株進行比較，鑒定其是否與原接種菌株一致。每菌株設4個重復。

2結果與分析

2.1重寄生菌的寄生現(xiàn)象及自然寄生率

野外觀察發(fā)現(xiàn)，重寄生菌在石楠銹孢銹菌上的寄生較為相似，在寄生初期，可見在石楠銹孢銹菌的銹子器和散落出來的金黃色的銹孢子堆上出現(xiàn)點狀菌落，隨后菌落逐漸擴大覆蓋整個銹子器及銹孢子堆(圖1B)。隨時間的推移，銹子器逐漸干癟萎縮壞死。鏡檢發(fā)現(xiàn)，重寄生菌寄生后的銹子器內有重寄生菌的菌絲體生長，而銹子器內的銹孢子變形，顏色由黃色變?yōu)闊o色且內含物濃縮或溢出或整個孢子遭到破壞(圖1C)。重寄生菌對銹菌寄主石楠葉的傷害差異很大，主要有3種表現(xiàn)：①重寄生菌寄生銹子器后，后期銹子器周圍有限組織干枯壞死成灰白色枯斑并逐漸穿孔脫落(圖1D)；②重寄生菌寄生后對石楠葉的傷害僅局限在銹子器生長部位，不會引起周圍組織的褐變壞死，但寄生部位的葉組織變形凸起且呈黑色(圖1E)；③重寄生菌寄生后除引起銹菌生長部位褐變外，還會不斷引起周圍組織的褐變壞死，尤其在寄生的中后期，葉片的大部分或整個葉都會褐變壞死(圖1F)。

A.正常銹子器及銹孢子；B.重寄生菌在銹子器上形成的菌落(a)；C.銹子器內的重寄生菌菌絲體(b)及變色死亡的銹孢子(c)；D.干癟萎縮的銹子器(d)及其周圍的灰白色枯斑；E.凸起呈黑色的銹子器及周圍未受影響的葉；F.褐變壞死的銹子器及大面積褐變的葉。

圖1石楠銹孢銹菌的自然重寄生現(xiàn)象

石楠銹孢銹菌重寄生菌在野外于7月底逐漸發(fā)生，8—10月份其重寄生率呈緩慢的上升趨勢，至10月底其重寄生率不足20%。在11—12月份，重寄生菌的寄生率快速增長，并于12月中旬達到增長高峰，重寄生率超過了50%，最高達到59%(表1)。重寄生率的不斷上升與重寄生菌分生孢子的不斷產(chǎn)生、傳播和對寄主菌的反復侵染密切相關。

表1　石楠銹孢銹菌重寄生菌的重寄生情況

2.2菌種分離及鑒定

從供試材料上分離獲得的菌株及鑒定結果見表2。表2顯示，從3個樣點采集的材料，采用2種分離方法分離6批，共獲得真菌425株。其中已鑒定到屬的有347株，分屬于5個屬，鑒定到種的有1種28株，不產(chǎn)孢尚不能判斷其歸屬的有50株。雖然采樣點不同，分離方法有異，但各樣點采集的材料分離的結果呈現(xiàn)出較大的相似性，鏈格孢(Alternaria)、枝孢(Cladosporium)和擬盤多毛孢(Pestalotiopsis)3個屬的真菌出現(xiàn)的頻率均較高。

2.3重寄生菌接種

20個供試菌株接種于石楠感病葉上的石楠銹孢銹銹子器后，除未知菌株SYW21外，其余6個屬的真菌菌株都能在石楠銹孢銹銹子器上定植生長，但不同菌株的生長狀況和對石楠葉的影響差異較大。19個菌株中(表3)，枝孢SYC24菌株在銹子器上的生長最好，鐮刀菌SYF02和SYF05、粉紅單端孢SYTr12、枝孢SYC02和擬盤多毛孢SYP08菌株的生長則相對較差，而其余菌株在銹子器上的生長良好，接種3d后菌絲已基本覆蓋整個銹子器。19株菌中除擬盤多毛孢SYP22和枝孢SYC02、SYC23外，其余菌株對石楠葉均有一定的傷害，其中鏈格孢屬的所有菌株和擬盤多毛孢SYP03對葉片的傷害程度最大，菌株接種3 d后隨著菌絲的生長蔓延，銹子器周圍葉組織便開始逐漸褐變直至局部或整葉壞死。因此，19個供試菌株中能在石楠銹孢銹銹子器上旺盛生長且對石楠不造成傷害的重寄生菌為枝孢SYC23和擬盤多毛孢SYP22菌株。將以上各屬真菌菌塊直接置于保濕濾紙上培養(yǎng)，菌絲不生長或生長很差，只能形成稀疏的菌落，遠不及在銹子器上的生長情況，且隨著時間的延長，置于濾紙片上的菌塊及其所形成的菌落逐漸枯萎、干癟，不再生長。上述結果表明，這些真菌均有賴于銹孢銹銹子器內的銹孢子提供營養(yǎng)進行生長。

表2　各樣點分離得到的真菌菌株及鑒定結果

表3　接種后各菌株菌絲生長狀況及其對石楠葉和銹孢子活力的影響

注：表中接種和對照1中，“-”為菌絲未生長或葉片未見損傷；“+”為菌絲在銹子器上少量生長或著生銹子器部位葉出現(xiàn)褐斑；“++”為菌絲在銹子器上生長良好但尚未完全覆蓋遮蔽銹子器或銹子器著生部位及周圍有限范圍內的葉組織出現(xiàn)褐變；“+++”為菌絲在銹子器上旺盛生長幾乎完全覆蓋遮蔽銹子器或銹子器著生部位及周圍葉組織大部分出現(xiàn)褐變；“++++”表示菌絲生長旺盛且已完全覆蓋遮蔽銹子器或接種葉幾乎整葉褐變壞死。對照2中，“-”為菌塊無明顯變化，僅在菌塊上長出少量菌絲，菌絲向外不延伸；“+”為菌塊上菌絲向周圍延伸形成小的稀疏菌落?！啊獭睘槌霈F(xiàn)此現(xiàn)象，“○”為無此現(xiàn)象。

對接種重寄生菌3 d后的銹孢子進行顯微觀察，發(fā)現(xiàn)重寄生菌不僅能使銹孢子明顯褪色、變形，還能對銹孢子的外部結構或內部結構造成一定破壞而導致孢子死亡。供試菌株中的枝孢SYC17、SYC23、SYC24菌株和木霉SYT01菌株接種后的銹孢子可見銹孢子壁破裂，內含物濃縮、外溢，孢子死亡，其中尤以枝孢SYC24(圖2B)和木霉SYT01最為顯著，孢子死亡率均達到100%。而其他重寄生菌接種后的銹孢子外壁幾乎未受到明顯破壞，但內含物均不同程度發(fā)生濃縮且能被臺盼藍染色，表明銹孢子活力減弱甚至死亡。其中以擬盤多毛孢SYP03(圖2C)、枝孢SYC06及3株鏈格孢接種后的銹孢子內含物濃縮現(xiàn)象最為明顯，孢子死亡率最高，均達到100%。

A.對照銹孢子(正常銹孢子)；B.接種SYC24后的銹孢子(壁破裂，內含物濃縮)；C.接種SYP03后的銹孢子(孢子褪色、內含物濃縮)。

2.4重寄生菌再分離

重寄生菌再分離結果顯示(表4)，從鏈格孢、鐮刀菌、枝孢、擬盤多毛孢、木霉及粉紅單端孢6個屬的19個供試菌株接種后的銹子器上進行菌株再分離，均能得到與原菌株相同的真菌，說明銹子器及銹孢子的死亡均是以上菌株的作用所致，所以供試19個菌株均為石楠銹孢銹菌的重寄生菌。未知菌株SYW21在銹子器上不能生長，因此未對其進行再分離。

表4　供試菌株的再分離結果

注：“√”表明再分離所得菌株與原菌株(對照2)一致。

3討論

目前已發(fā)現(xiàn)的銹菌重寄生菌有銹生座孢屬(Tuberculina)[3-4,8]、銹寄生孢(Darlucafilum)[11]、鐮刀菌屬[12]、枝頂孢屬(Acremonium)[13]、枝孢屬[14]和木霉屬[2,9]等多個屬的真菌。本研究對石楠銹孢銹菌重寄生菌進行研究，發(fā)現(xiàn)其重寄生菌種類較多，涉及鏈格孢、鐮刀菌、枝孢、擬盤多毛孢、木霉的種及粉紅單端孢，雖然它們對銹菌都有一定的控制作用，但不同屬及同屬不同種的菌株對銹菌寄主的傷害差異很大，因此對那些嚴重傷害寄主植物的菌株，不能將其直接用于生物防治，但其活性成分值得進一步研究。

已有的研究表明，重寄生菌作為生防菌在野外防治某些植物銹病效果顯著，具有很好的開發(fā)應用前景[15-18]。本研究對篩選獲得的石楠銹孢銹重寄生菌的部分菌株在室內進行了接種試驗，發(fā)現(xiàn)擬盤多毛孢SYP22菌株和枝孢SYC23菌株接種對銹菌寄主石楠沒有傷害且能在石楠銹孢銹的銹子器上很好地生長并能有效破壞銹子器及銹孢子，具有優(yōu)良生防菌的特點。由于本研究僅進行了室內接種試驗，野外表現(xiàn)是否與其一致還有待進一步研究。此外，針對它們是否對其它銹菌也有相同作用，筆者用SYC23菌株的孢子懸浮液，接種了茶藨生柱銹和梨膠銹(Gymnosporangiumharaeanum)的銹孢子堆以及竹稈銹(Stereostratumeortieioides)的冬孢子堆和夏孢子堆，發(fā)現(xiàn)它們均能在這些銹菌孢子堆上萌發(fā)并正常生長，表明實驗室條件下該菌株也能利用其他銹孢子作為養(yǎng)分生長，因此推測其對其他銹菌也應有一定作用，值得進一步研究。

重寄生菌的作用機理主要是通過分泌幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶破壞寄主菌細胞壁的骨架結構導致細胞死亡，或分泌毒素物質破壞寄主菌細胞膜的完整性導致細胞內部結構改變而引起細胞死亡，或既分泌胞壁降解酶也產(chǎn)生毒素共同破壞寄主菌[19-21]。本研究中SYC17、SYC23、SYC24和SYT01菌株均能破壞銹孢子壁，導致細胞質外溢，說明它們也能夠分泌細胞壁降解酶,而其它菌株處理后的銹孢子細胞壁未受到明顯破壞，但內含物濃縮且能被臺盼藍染色，表明它們可能以分泌的毒素物質使銹孢子失活。因此，本研究分離得到的石楠銹孢銹菌重寄生菌的寄生機理存在著一定差異，后續(xù)應從生物學特性和重寄生機理兩方面對篩選獲得的菌株進行更深入地研究，進而篩選出有應用前景的重寄生菌，為植物銹病的生物防治奠定基礎。

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收稿日期：2015年1月25日。

第一作者簡介：李夢婕，女，1990年1月生，西南林業(yè)大學生命科學學院，碩士研究生。E-mail：148336965@qq.com。通信作者：陳玉惠，西南林業(yè)大學生命科學學院，教授。E-mail：cyh196107@126.com。

1)云南省優(yōu)勢特色重點學科生物學一級學科建設項目(50097505)。

責任編輯：程紅。