陳敏氡 朱海生

摘 要 為建立草莓葉葉黃素循環(huán)組分超高效液相色譜（UPLC）的分析方法，優(yōu)化草莓葉葉黃素循環(huán)組分的提取條件，建立適宜的UPLC測定方法，通過研究強光下各組分含量的變化規(guī)律進行驗證，結(jié)果表明，以丙酮為提取劑，不經(jīng)過皂化直接提取，采用C18色譜柱，以乙腈 ∶ 甲醇=9 ∶ 1為流動相，流速0.5 mL/min，波長445 nm，柱溫30 ℃能較好地分離及測定草莓葉葉黃素循環(huán)各組分，方法快速穩(wěn)定，檢測時間僅需1.2 min。強光下，玉米黃質(zhì)、葉黃素循環(huán)庫和脫環(huán)氧化程度均明顯升高而紫黃質(zhì)下降，符合葉黃素循環(huán)調(diào)控規(guī)律，證實此方法可靠。可見，實驗所建立的UPLC測定方法適合草莓葉葉黃素循環(huán)組分分析。

關(guān)鍵詞 草莓葉；葉黃素循環(huán)組分；UPLC

中圖分類號 S668.4 文獻標識碼 A

草莓（Fragaria ananassa Duch.）喜溫暖而不耐高溫強光，在越夏露地栽培時比一般果菜類更易發(fā)生光抑制，光損傷，嚴重影響其品質(zhì)及產(chǎn)量[1-3]。目前，有關(guān)葉黃素循環(huán)對草莓葉片光系統(tǒng)的保護作用成為研究者關(guān)注的熱點。徐凱等[4]研究了草莓葉片光合作用對強光的響應(yīng)，推測葉黃素循環(huán)在草莓葉片防御光損傷方面起著重要作用。張廣華等[5]發(fā)現(xiàn)，草莓葉片在光抑制過程中，依賴葉黃素循環(huán)的熱耗散是其排散過剩光能的重要途徑之一。鄭毅等[6]認為，葉黃素循環(huán)是草莓葉片在溫度脅迫下主要的自我保護機制。葉黃素循環(huán)（Xanthophyll cycle）主要由玉米黃質(zhì)（Zeaxanthin，Z）、環(huán)氧玉米黃質(zhì)（Antheraxanthin，A）和紫黃質(zhì)（Violaxanthin，V）3種組分參與，明確Z、A和V含量以及葉黃素循環(huán)庫（V+A+Z）、葉黃素循環(huán)脫環(huán)氧化狀態(tài)（A+Z）/（V+A+Z）在光抑制中的變化特性是闡明葉黃素循環(huán)光保護機制的關(guān)鍵[7-9]。因此，在草莓上，急需建立一種快速、準確的葉黃素循環(huán)組分（A、V和Z）的測定方法，分析各組分在光抑制中變化規(guī)律，這將對今后探索草莓葉黃素循環(huán)在保護光系統(tǒng)和抗逆中的作用產(chǎn)生重要意義。高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）是近年來分離及測定植物天然色素的主要方法，但在實際應(yīng)用中仍然存在分析時間長，分離效果不佳等缺陷[10]。Cheng等[11]采用Zorbax-ODS色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），甲醇 ∶ 乙腈（75 ∶ 25）和甲醇 ∶ 乙酸乙酯（70 ∶ 30）為流動相分離蘋果葉片中的紫黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)和玉米黃質(zhì)耗時20 min以上。韋朝領(lǐng)等[12]利用Spherisorb C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）對茶葉中葉黃素循環(huán)組分進行分析，檢測時間15 min。崔海巖等[13]通過Spherisorb C18色譜柱（4.0 mm×250 mm，5 μm）可在8 min內(nèi)完成玉米葉片葉黃素循環(huán)組分的定性定量，然而流動相中添加Tris-HCl緩沖液而存在管路堵塞的風險。超高效液相色譜法（Ultra performance liquid chromatography，UPLC）是基于HPLC推出的一種新型的液相色譜技術(shù)，它使用粒徑低于2 μm的小顆粒填充色譜柱提升樣品的分析效率，彌補了HPLC的缺陷，分離速度、靈敏度以及分離度高達HPLC的9、3、1.7倍，且在HPLC的基礎(chǔ)上兼具環(huán)境友好、成本低等特點，已逐漸成為食品分析檢測的有效工具[14-15]。目前，UPLC技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到草莓果實葉黃素、番茄紅素和β-胡蘿卜素等多種類胡蘿卜素的測定，測定時間僅5 min，比普通HPLC縮短約70%[16]。葉黃素循環(huán)的3種組分均屬于類胡蘿卜素，因此，同樣可以將UPLC技術(shù)運用到葉黃素循環(huán)組分的測定，獲得快速、穩(wěn)定的草莓葉葉黃素組分分析方法。本試驗通過優(yōu)化草莓葉片葉黃素循環(huán)組分的提取條件，建立適宜的UPLC分析方法，并通過研究強光下草莓葉片葉黃素循環(huán)組分含量的變化規(guī)律對此方法進行驗證，從而確定適合草莓葉葉黃素循環(huán)組分分析的方法，為今后進一步研究草莓葉葉黃素循環(huán)在光系統(tǒng)和逆境中的作用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料與處理 試驗于2014-2015年在福建省福清東張試驗基地進行，供試材料為自主選育草莓品種“福莓1號”。選取生長健壯的三葉一心苗，移栽到直徑160 mm，高140 mm的塑料盆中，生長期間保證水肥充足，常規(guī)管理。當植株張至6～7片葉，選取大小和生長狀態(tài)一致的草莓盆栽苗，將盆栽苗從室外移至室內(nèi)預(yù)培養(yǎng)一周，每天光照10 h，光源為鏑燈，接著取3盆長勢一致的草莓苗進行模擬強光脅迫（光強2 000 μmol/（m2·s），溫度（25±1）℃ 3 h，以未經(jīng)處理的盆栽為對照，試驗重復(fù)3次，取大小相同的功能葉數(shù)片，放入液氮中速凍待測。

1.1.2 試劑 玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)為標準樣品（ChromaDex，USA），純度均為95%以上；乙腈和甲醇為色譜純（Fisher，USA）；甲醇、乙醇、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、無水硫酸鈉均為分析純，購自上海國藥集團。

1.1.3 儀器 超高效液相色譜儀ACQUITY UPLC H-Class（Waters，USA），光電二極管矩陣檢測器eλPDA（Waters，USA），ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）（Waters，USA），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RV10（IKA，Germany），紫外分光光度計Ultrospec1100 pro（Amersham，USA），超聲波粉碎儀VCX130PB（Sonics，USA）等。

1.2 方法

1.2.1 草莓葉葉黃素循環(huán)組分的提取 用液氮將草莓葉片研磨至粉末，準確稱取0.1 g，加入5 mL丙酮提取劑，于4 ℃避光浸提5 min，低溫超聲提取2 min，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液，重復(fù)操作1次，合并上清液，定容至10 mL，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40 ℃將其蒸干，用丙酮定容至5 mL，4 ℃避光放置。

提取劑的優(yōu)化：選擇7種不同極性的有機溶劑或組合，依次為：甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、丙酮石油醚（4 ∶ 1）、丙酮石油醚（1 ∶ 1）、石油醚。分析不同提取劑對草莓葉葉黃素循環(huán)各組分含量總和（即葉黃素循環(huán)庫）的提取效果，確定最適提取劑。

提取方法的優(yōu)化：采用非皂化和皂化2種方法對草莓葉葉黃素循環(huán)組分進行提取，其中皂化提取參照草莓類胡蘿卜素的皂化方法[16]，通過分析二者對草莓葉葉黃素循環(huán)庫的提取效果，確定適用的提取方法。

1.2.2 標準溶液的配制 將玉米黃質(zhì)標準樣品用丙酮配制成濃度為20 μg/mL的標準溶液，紫黃質(zhì)和環(huán)氧玉米黃質(zhì)標準樣品用乙醇分別配制成濃度為0.8和0.4 μg/mL的標準溶液，放置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 UPLC色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈 ∶ 甲醇=9 ∶ 1（V/V）；流速：0.5 mL/min；進樣體積：10 μL；色譜柱溫度：30 ℃；樣品溫度：30℃；波長掃描范圍：100～600 nm；檢測波長：445 nm。

1.2.4 標準工作曲線的制備 將1.2.2配制3種標準溶液逐個稀釋成不同濃度梯度的標準溶液，按1.2.3的色譜條件進行測定。以標準樣品濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），繪制標準工作曲線并計算標準曲線回歸方程以及相關(guān)系數(shù)，

1.2.5 精密度、重復(fù)性試驗 將3種標準樣品的混合標準溶液按1.2.3的色譜條件進行5次連續(xù)進樣，以各組分峰面積的相對標準偏差（Relative standard deviation，RSD），來檢測該方法的精密度。平行制備5份樣品，按照1.2.1的提取方法及1.2.3的色譜條件進行測定，計算各組分峰面積的RSD來考察方法的重復(fù)性。

1.2.6 加標回收試驗 稱取4份等量的草莓葉片粉末，其中3份如表3所示分別進行3個水平的加標，余下1份作空白對照。按1.2.1的方法提取樣品，按1.2.3的色譜條件分析樣品中葉黃素循環(huán)組分含量，計算回收率及回收率的RDS，試驗平行測定3次。

1.2.7 草莓葉葉黃素循環(huán)組分含量的測定 利用1.2.3的色譜條件分別對強光脅迫處理及未處理的草莓葉片中玉米黃質(zhì)，紫黃質(zhì)和環(huán)氧玉米黃質(zhì)含量進行測定，測定樣品前用流動相進行稀釋，并經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，試驗平行測定5次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010和SPSS 17.0軟件對測定的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓葉片葉黃素循環(huán)組分提取條件的優(yōu)化

2.1.1 不同提取劑提取效果的比較 由圖1可以看出，7種提取劑的提取效果存在顯著差異，極性高的提取劑如甲醇、乙醇和丙酮等提取效果較好；反之，極性低的石油醚提取效果最差。其中，通過甲醇或丙酮所提取的葉黃素循環(huán)庫含量最高，與石油醚的提取效果存在顯著差異（p<0.05）?？梢姡柽x擇極性高的提取劑來提取草莓葉葉黃素循環(huán)各組分。

2.1.2 不同提取方法提取效果的比較 由圖2可以看出，采用非皂化和皂化2種方法所提取的葉黃素循環(huán)庫含量差異較大，皂化處理明顯損耗草莓葉片葉黃素循環(huán)庫的含量。因此，確定不經(jīng)皂化而直接提取草莓葉片葉黃素循環(huán)各組分。

2.2 UPLC分析條件的優(yōu)化選擇

2.2.1 檢測波長的選擇 對玉米黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)和紫黃質(zhì)3種標準樣品的光譜掃描發(fā)現(xiàn)，3種標準樣品的吸收峰均集中在445 nm左右，玉米黃質(zhì)的最大吸收波長為450 nm，紫黃質(zhì)為440 nm，環(huán)氧玉米黃質(zhì)為449 nm，并且考慮到前人在分析植物葉黃素循環(huán)組分時也有采用445 nm作為檢測波長[11-12]。因此，選擇445 nm作為草莓葉葉黃素循環(huán)組分測定的檢測波長。

2.2.2 色譜條件的確定 由于葉黃素循環(huán)的3種組分均屬于類胡蘿卜素。因此，本實驗參照草莓果實類胡蘿卜素UPLC方法的色譜條件[16]對三者進行分析，結(jié)果3種組分的分離效果較好，說明該色譜條件適用于葉黃素循環(huán)組分的分析，但由于本實驗采用是柱長為100 mm的色譜柱，較于原來柱長50 mm的色譜柱分析時間明顯增加，因此通過改進原來的色譜條件參數(shù)，包括提高進樣體積、色譜柱溫度以及樣品溫度，從而縮短分析時間。最終確定的色譜條件為乙腈 ∶ 甲醇=9 ∶ 1（V/V）為流動相，流速0.5 mL/min，進樣體積10 μL，柱溫30 ℃，樣品溫度30 ℃，在此色譜條件下3種標準樣品可以完全分離，峰形對稱性好，并且分析時間較短（圖3）。

2.3 UPLC分析方法的可靠性分析

2.3.1 線性關(guān)系及檢出限、定量限測定 由表1可知，玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)和環(huán)氧玉米黃質(zhì)的線性相關(guān)系數(shù)依次為0.995 0、0.999 5、0.999 9，表明3種標準樣品的進樣濃度與峰面積具有良好的線性關(guān)系。以信噪比（S/N）為3所對應(yīng)的標準樣品濃度為檢出限，以信噪比（S/N）為10所對應(yīng)的標準樣品濃度為定量限，3種標準樣品的檢出限為0.003～0.01 μg/mL，定量限為0.005～0.02 μg/mL，說明該方法具有較高的靈敏性。

2.3.2 精密度、重復(fù)性試驗 由表2可知，玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)和環(huán)氧玉米黃質(zhì)3種組分在精密度試驗中對應(yīng)的RSD依次為0.3%、0.7%和1.2%，重復(fù)性測定中玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)和環(huán)氧玉米黃質(zhì)3種組分對應(yīng)的RSD依次為0.5%、0.9%、1.3%，均小于2%，表明該方法具有良好的精密度和重復(fù)性。

2.3.3 加標回收試驗 由表3可得，玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)和環(huán)氧玉米黃質(zhì)3種標準樣品的回收率為95.6%-104.9%，均在95%以上，并且回收率的相對標準偏差為0.9%～1.7%，均小于2%，表明此方法符合分析要求。

2.4 草莓葉片葉黃素循環(huán)組分含量的測定

由圖4看出，在445 nm下可檢測到3種物質(zhì)，它們的保留時間與3種標準樣品的保留時間依次相差0.006、0.009、0.011 min。因此，確定3個物質(zhì)分別為紫黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)和玉米黃質(zhì)。由表4可得，未處理的草莓葉片中紫黃質(zhì)（V）、環(huán)氧玉米黃質(zhì)（A）和玉米黃質(zhì)（Z）的含量依次為80.2、24.1、475.1 μg/g，Z的含量分別約為V和A的5.9倍和19.7倍，可見Z是草莓葉黃素循環(huán)中的主要組分。強光脅迫后，葉片中的Z含量明顯升高，V含量下降，A含量基本不變，Z從475.1變?yōu)?51.3 μg/g，升高1.16倍，而V則從80.2降至53.9 μg/g。此外，葉黃素循環(huán)庫（A+V+Z）和脫環(huán)氧化狀態(tài)水平（A+Z）/（A+Z+V）也在強光處理后明顯升高，結(jié)果符合葉黃素循環(huán)調(diào)控規(guī)律，說明該方法可用于草莓葉葉黃素循環(huán)組分的分析。

3 討論與結(jié)論

本實驗選擇極性不同的7種提取劑，即甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、丙酮 ∶ 石油醚（4 ∶ 1）、丙酮 ∶ 石油醚（1 ∶ 1）和石油醚，通過比較各個提取劑對草莓葉葉黃素循環(huán)組分的提取效果來獲得適合的提取劑。結(jié)果表明，7種提取劑的提取效果差異顯著，極性高的單一提取劑如甲醇、乙醇、丙酮的提取效果好，反之，極性低的石油醚效果差，推測可能與玉米黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)和紫黃質(zhì)中含有強極性的羥基、羰基、甲氧基或環(huán)氧化結(jié)構(gòu)有關(guān)[17]。在7種提取劑中，利用甲醇或丙酮所提取的葉黃素循環(huán)組分含量最高，可見，甲醇和丙酮均是提取草莓葉片中葉黃素循環(huán)組分較好的提取劑，但考慮到甲醇的毒性較大，因此建議使用丙酮進行提取。目前，利用皂化和非皂化的方法提取植物葉片中的葉黃素循環(huán)組分均有報道[12，18]。皂化處理可以解決玉米黃質(zhì)在有機浸提過程中難以分離等問題，然而皂化的過程常常會導(dǎo)致樣品中色素單量以及總量不同程度的損失，而在水果類物質(zhì)中類胡蘿卜素皂化提取的損失率約為10%～15%[19-21]。因此，需要比較2種方法對草莓葉片葉黃素循環(huán)組分的提取效果，以獲得最適的提取方法。結(jié)果表明，皂化處理會損耗草莓葉片中的葉黃素循環(huán)組分，直接提取效果更好。

針對葉黃素循環(huán)組分建立有效的測定方法是開展草莓葉葉黃素循環(huán)調(diào)控作用研究的必備基礎(chǔ)。目前，絕大多數(shù)的測定手段還是以普通高效液相色譜（HPLC）為主，然而HPLC在實際應(yīng)用中存在耗時長，分離度不佳等缺陷[11-13]。因此，尋求更高效的檢測方法是未來的研究重點。超高效液相色譜法（UPLC）是近年來發(fā)展較快，基于HPLC的新型液相色譜檢測技術(shù)。它的最大優(yōu)勢在于采用了2.0 μm以下顆粒度的色譜填料柱，以及耐受超高壓的色譜泵和色譜系統(tǒng)，現(xiàn)已成為蛋白組學、藥物分析、環(huán)境監(jiān)測等眾多高端領(lǐng)域的有效檢測方法[22-23]。眾多研究表明，將HPLC定量方法轉(zhuǎn)換并優(yōu)化為UPLC方法，在保證含量測定結(jié)果準確的前提下，既提高了色譜峰分離度，加快了分析速度，達到了樣品分析的高通量，又減少了溶劑損耗及廢液處置費用，降低了分析成本[24-25]。本試驗利用UPLC分析了草莓葉葉黃素循環(huán)組分，相較于普通HPLC技術(shù)凸顯了2點優(yōu)勢：（1）分析時間明顯縮短。利用UPLC 僅僅在1.2 min內(nèi)就能檢測出葉黃素循環(huán)的3種組分，對比韋朝領(lǐng)[12]、季本華等[26]利用HPLC的分析時間，縮短近85%以上。（2）分析方法更簡單、安全，成本降低。試驗的流動相只需要乙腈和甲醇，避免使用了Glimore等[27]和趙世杰等[28]方法中對色譜柱有害的Tris-HCl緩沖液；分析過程以乙腈 ∶ 甲醇=9 ∶ 1（V/V）等度洗脫即可，無需通過梯度洗脫，較于徐坤[29]，崔海巖等[13]報道中的提取過程更簡單，此外還明顯減少了溶劑損耗，節(jié)約了分析成本。

本研究通過優(yōu)化葉黃素循環(huán)組分的提取條件，確定色譜條件以及線性關(guān)系、重復(fù)性、精密度、回收率試驗等的考察獲得了最適的草莓葉葉黃素循環(huán)UPLC分析方法，即以丙酮為提取劑，不經(jīng)過皂化直接提取，同時采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱，以乙腈 ∶ 甲醇=9 ∶ 1為流動相，流速0.5 mL/min，波長445 nm，色譜柱溫度30 ℃，樣品溫度30 ℃。此外，通過研究強光下葉黃素循環(huán)各組分含量的變化規(guī)律對該方法進行驗證，結(jié)果符合葉黃素循環(huán)調(diào)控規(guī)律。因此，確定試驗所建立的UPLC測定方法適合草莓葉葉黃素循環(huán)組分分析。

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