王海波 李璐 蘇新國 張昭其 龐學(xué)群

摘要：【目的】探討MaHSFA1和MaHSP70基因在熱處理誘導(dǎo)香蕉抗冷性中的作用，為有效延長香蕉貯運(yùn)期提供參考依據(jù)?！痉椒ā繌南憬痘蚪M數(shù)據(jù)庫（http：//banana-genome.cirad.fr/）中搜索到MaHSFA1和MaHSP70基因序列，分別設(shè)計特異引物，利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測這2個基因在香蕉熱處理和低溫貯藏中的表達(dá)情況?！窘Y(jié)果】MaHSFA1基因與其他物種的HSFA1基因同源性較低，僅在HSF DNA-bind區(qū)域的保守性很高；MaHSP70基因含有一個HSPA1-2，6-8-like NBD區(qū)域，且與其他物種的HSP70基因同源性很高。7 ℃冷藏誘導(dǎo)香蕉果實的MaHSFA1和MaHSP70基因表達(dá)量整體上呈下降趨勢。經(jīng)52 ℃熱水處理誘導(dǎo)的MaHSFA1基因表達(dá)增強(qiáng)，且在熱激處理后0.5 h有一個小高峰；在7 ℃低溫貯藏過程中，經(jīng)熱處理后的MaHSFA1基因表達(dá)量在貯藏4.0 h時迅速升高至最大值，之后又迅速下降；MaHSP70基因表達(dá)量在熱激處理后0.5 h迅速升高至最大值，約是對照處理（未經(jīng)熱激處理）的4倍，之后逐漸下降。在整個試驗過程中除7 ℃貯藏120.0 h外，其他時段熱激處理的MaHSFA1和MaHSP70基因表達(dá)量均高于對照處理?！窘Y(jié)論】采后香蕉果實的抗冷性與MaHSFA1和MaHSP70基因表達(dá)增強(qiáng)密切相關(guān)，生產(chǎn)上可通過熱處理提高香蕉果實的抗冷性，進(jìn)而延長貯運(yùn)期。

關(guān)鍵詞： 香蕉；MaHSFA1基因；MaHSP70基因；熱處理；抗冷性

中圖分類號： S668.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）06-0873-06

0 引言

【研究意義】香蕉屬冷敏性水果，貯藏溫度低于12 ℃時即發(fā)生冷害，因而難以通過低溫措施而延長貯運(yùn)期（陸旺金等，1999；張昭其和龐學(xué)群，2008）。熱處理是提高果蔬抗冷性的最有效采后處理措施之一（王海波等，2015），但熱處理誘導(dǎo)的抗冷機(jī)制，特別是有關(guān)的信號傳導(dǎo)途徑目前尚不清楚。因此，對香蕉熱激轉(zhuǎn)錄因子（Heat shock transcription factor，HSF）和熱激蛋白（Heat shock protein，HSP）進(jìn)行深入研究，有助于揭示熱處理提高香蕉果實抗冷性的作用機(jī)理?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】HSF-HSP途徑是植物響應(yīng)高溫脅迫的主要途徑，在植物耐熱性的產(chǎn)生過程中發(fā)揮重要作用（Wahid et al.，2007）。HSF是HSP的上游調(diào)控因子，通過結(jié)合到熱激元件（Heat shock element，HSE）上而直接啟動下游HSP基因的表達(dá)（Nover，1987；Harrison et al.，1994）。目前，已有大量研究證實，HSP產(chǎn)生與采后果蔬抗冷性的增強(qiáng)密切相關(guān)。番茄果實經(jīng)熱空氣處理（38 ℃，48 h）后HSP積累，有效減輕了果實在2 ℃冷藏中的冷害癥狀（Sabehat et al.，1996）；李果實經(jīng)熱處理后在低溫下冷藏，其HSP基因表達(dá)仍保持較高水平，果實的耐冷性增強(qiáng)（Sun et al.，2010）。此外，葡萄柚（Rozenzvieg et al.，2004）、葡萄（張俊環(huán)和黃衛(wèi)東，2006）、楊梅（汪開拓和鄭永華，2011）等經(jīng)熱處理后均能通過產(chǎn)生HSP或誘導(dǎo)HSP基因表達(dá)增強(qiáng)，從而提高采后果蔬在冷藏中的抗冷性?！颈狙芯壳腥朦c】本課題組的前期研究結(jié)果表明，采用52 ℃熱水處理香蕉果實3 min，能有效減輕香蕉果實的冷害癥狀（Wang et al.，2008，2012；王海波等，2012），但有關(guān)熱處理誘導(dǎo)香蕉果實產(chǎn)生的抗冷性是否與HSFA1和HSP70基因相關(guān)目前尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對HSFA1和HSP70基因在香蕉熱處理和低溫貯藏中的表達(dá)進(jìn)行對比分析，探討這2個基因在熱處理誘導(dǎo)香蕉抗冷性中的作用，為有效延長香蕉貯運(yùn)期提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

香蕉品種為巴西（Musa spp. AAA group cv. Brazil），采自廣州市番禺香蕉園，及時運(yùn)回廣東省果蔬保鮮重點實驗室。挑選七成飽滿、大小均勻、無病蟲害及機(jī)械損傷的單個香蕉，先后用0.1%漂白粉和0.05%施保功各浸泡5 min，晾干后備用。

熱水及低溫貯藏處理：將香蕉果實浸入熱水處理機(jī)（400 L）中，溫度52 ℃，時間3 min。熱水處理后將香蕉果實放入20 ℃恒溫箱中貯藏3 h（Wang et al.，2012），然后置于7 ℃下貯藏5 d；對照處理的香蕉在20 ℃恒溫箱中貯藏3 h，然后置于7 ℃下貯藏5 d。每處理處理100個香蕉，定期取樣備用。取樣時間點為：20 ℃下0、0.5、1.5和3.0 h；7 ℃下1.0、4.0、8.0、24.0、48.0和120.0 h。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 引物設(shè)計 從香蕉基因組數(shù)據(jù)庫（http：//ba-

nana-genome.cirad.fr/）中搜索HSP70和HSFA1基因序列，分別命名為MaHSP70和MaHSFA1，然后采用Primer Premier 5.0設(shè)計引物，引物序列為MaHSP70 （5'-GGCAATCAGTTGGCAGAAG-3'和5'-ACCAGCA

GAGGGTGCGTCA-3'）和MaHSFA1（5'-TACCTCCGA

TATGGACATCTTAA-3'和5'-TAGCCCTATTTCCTC

AGTTTCA-3'）。

1. 2. 2 實時熒光定量PCR（qRT-PCR） 采用TOYO-

BO THUNDERBIRD SYBR■ qPCR Mix 進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系20.00 μL：SYBR-Green PCR Master Mix 10.00 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.25 μL，稀釋的cDNA 2.00 μL，ddH2O 7.50 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 10 s，59 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，進(jìn)行40個循環(huán)。為了確認(rèn)產(chǎn)物的質(zhì)量和引物的特異性，在融解曲線中分析產(chǎn)物的Tm（融解溫度為65～95 ℃）。所有qRT-PCR結(jié)果根據(jù)內(nèi)參基因Actin1進(jìn)行閾值循環(huán)數(shù)（Ct）值校準(zhǔn)，再利用2-△△Ct計算目的基因的相對表達(dá)量，重復(fù)3次。

1. 3 統(tǒng)計分析

利用DNAMAN對擴(kuò)增獲得的基因序列進(jìn)行同源性比對分析，通過NCBI網(wǎng)站中的BLAST進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，并采用Sigmaplot 12.5制作折線圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 MaHSFA1和MaHSP70基因的序列分析結(jié)果

經(jīng)DNAMAN比對及NCBI網(wǎng)站BLAST分析可知，HSFA1基因在不同物種中的同源性較低，但在HSF DNA-bind區(qū)域的保守性很高（圖1的下劃線部分）。其中，MaHSFA1與油棕EgHSFA1（XP_010943416.1）的同源性為59%，與海棗PdHSFA1（XP_008777830.1）的同源性為57%，與水稻OsHSFA1（XP_015630421.1）的同源性為53%，與小麥TaHSFA1（AHZ44764.1）的同源性為51%，與擬南芥AtHSFA1（AEE83945.1）的同源性為26%?；贖SFA1基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹如圖2所示，油棕EgHSFA1與海棗PdHSFA1先聚為一支，再與MaHSFA1聚為一個大支。

由圖3可以看出，HSP70基因在不同物種中保守性很高，含有一個HSPA1-2，6-8-like NBD區(qū)域（下劃線部分）。MaHSP70與油棕EgHSP70（XP_010937646.1）的同源性為96%，與水稻OsHSP70（XP_015616495.1）的同源性為95%，與野生大豆GsHSP70（KHN13891.1）、煙草NtHSP70（AAR17080.1）、楊樹PtHSP70（XP_002-

311161.1）的同源性均為94%，與擬南芥AtHSP70（CAA05547.1）的同源性為92%?；贖SP70基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹如圖4所示，MaHSP70在92%處與其他參考物種聚為一支。

2. 2 熱激處理及熱激后低溫貯藏對MaHSFA1基因表達(dá)的影響

由圖5可以看出，對照處理的MaHSFA1基因表達(dá)量在7 ℃貯藏下呈先緩慢升高后迅速下降的變化趨勢，主要表現(xiàn)在前4.0 h有一個較小的增幅，之后逐漸下降至最低水平，且低于處理前的表達(dá)量。MaHSFA1基因表達(dá)在熱水處理后0.5 h有一個小高峰，且在0.5～3.0 h的表達(dá)量一直高于對照處理；在7 ℃低溫貯藏過程中，經(jīng)熱水處理的MaHSFA1基因表達(dá)量在7 ℃貯藏4.0 h時迅速升高至最大值，之后迅速下降，至8.0 h時其表達(dá)量已接近處理前的水平，后期MaHSFA1基因表達(dá)量繼續(xù)下降至最低水平。在整個試驗過程中，除7 ℃貯藏120.0 h時的熱水處理MaHSFA1基因表達(dá)量低于對照處理外，其他時段均高于對照處理。

2. 3 熱激處理及熱激后低溫貯藏對MaHSP70基因表達(dá)的影響

從圖6可以看出，對照處理的MaHSP70基因表達(dá)在7 ℃貯藏下呈逐漸下降趨勢，且一直維持在較低的表達(dá)水平。經(jīng)熱水處理后0.5 h，MaHSP70基因表達(dá)量迅速升高至最大值，約是對照處理的4倍，之后逐漸下降。經(jīng)熱水處理的MaHSP70基因表達(dá)在7 ℃貯藏下從1.0～4.0 h有微小的增幅，在8.0 h時迅速降低至熱處理前的水平。在整個試驗過程中，除7 ℃貯藏120.0 h時的熱水處理MaHSP70基因表達(dá)量與對照處理一致外，其他時段均高于對照處理。

3 討論

植物HSF分為HSFA、HSFB和HSFC三大類，其中 HSFA1基因在耐熱脅迫過程中發(fā)揮主要的調(diào)節(jié)作用，能誘導(dǎo)下游基因如HSP的表達(dá)，增強(qiáng)植物耐熱性（Liu et al.，2011；Guo et al.，2016）。如大豆GmHSFA1基因過表達(dá)能提高植株的耐熱性，其原因是激活了熱激下游基因如GmHsp70、GmHsp22或其他GmHsps基因的表達(dá)（Zhu et al.，2006）。百合組培苗經(jīng)42 ℃熱激處理1.0～12.0 h后，其葉片中的LlHsfA1基因相對表達(dá)量總體上呈“上升—下降”交替的變化趨勢；且百合葉片LlHsfA1基因在熱激處理2.0和9.0 h時分別出現(xiàn)一個表達(dá)高峰，表達(dá)量約是對照處理的4.3和3.3倍，但整個試驗過程中熱處理的LlHsfA1基因表達(dá)量始終高于對照處理（宮本賀等，2014）。本研究結(jié)果表明，MaHSFA1基因表達(dá)在熱水處理后0.5 h有一個小高峰，且在3.0 h內(nèi)的表達(dá)量一直高于對照處理。目前，有關(guān)HSFA1對低溫響應(yīng)的研究很少，本研究發(fā)現(xiàn)7 ℃低溫能導(dǎo)致MaHSFA1基因表達(dá)量下降，但預(yù)先經(jīng)熱激處理的MaHSFA1基因表達(dá)量在7 ℃貯藏4.0 h后迅速升高至最大值，之后又迅速下降至最低水平。在整個試驗過程中，除7 ℃貯藏120.0 h時的熱水處理MaHSFA1基因表達(dá)量低于對照處理外，其他時段均高于對照處理，說明MaHSFA1基因受低溫抑制、受高溫誘導(dǎo)增強(qiáng)，熱激處理能延緩MaHSFA1基因在7 ℃冷藏中表達(dá)量的下降，故推測熱激處理誘導(dǎo)香蕉產(chǎn)生的抗冷性與MaHSFA1基因表達(dá)增強(qiáng)密切相關(guān)。

HSP與熱激處理誘導(dǎo)采后果蔬抗冷性的增強(qiáng)密切相關(guān)。Sabehat等（1996）研究發(fā)現(xiàn)，番茄果實經(jīng)38 ℃處理48.0 h可提高其在2 ℃貯藏下的抗冷性，且番茄果實的HSP70、HSP18.1和HSP23基因的表達(dá)量明顯增加，即經(jīng)熱處理誘導(dǎo)產(chǎn)生的熱激蛋白能減輕番茄果實冷害的發(fā)生。Sevillano等（2010）研究表明，熱空氣處理（52 ℃，3 min）可減輕番荔枝果實的冷害癥狀，且果實的sHSP基因表達(dá)增加、sHSP活性增強(qiáng)，說明熱激蛋白可能參與了熱處理誘導(dǎo)的抗冷性。本研究結(jié)果表明，未經(jīng)熱水處理的MaHSP70基因表達(dá)量在7 ℃貯藏下呈逐漸下降趨勢，且一直維持在較低水平；香蕉經(jīng)熱處理0.5 h后其MaHSP70基因表達(dá)量迅速升高至最大值，約是未經(jīng)熱處理的4倍，之后逐漸下降。在整個試驗過程中，除7 ℃貯藏120.0 h時的熱水處理MaHSP70基因表達(dá)量與對照處理一致外，其他時段均高于對照處理，說明MaHSP70基因受低溫抑制、受高溫誘導(dǎo)增強(qiáng)，熱激處理誘導(dǎo)MaHSP70基因表達(dá)增強(qiáng)可能參與了低溫貯藏中香蕉的抗冷性過程。

4 結(jié)論

采后香蕉果實的抗冷性與MaHSP70和MaHSFA1基因表達(dá)增強(qiáng)密切相關(guān)，生產(chǎn)上可通過熱處理提高香蕉果實的抗冷性，進(jìn)而延長貯運(yùn)期。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）