吳麗麗 周延賓 蔡思琪 趙建國

摘 要 為建立雞早期性別鑒定的快速方法，根據(jù)雞CHD基因在性染色體Z和W上的序列長度差異，從雞血樣中提取基因組DNA，利用2550F/2718R和SF/SR引物分別對(duì)雞CHD基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。引物2550F/2718R 的PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，公雞為1條帶，約600 bp，母雞為2條帶，分別約為600 bp和450 bp；引物SF/SR PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，公雞為1條帶，約500 bp，母雞為2條帶，分別約為500 bp和350 bp；兩對(duì)引物擴(kuò)增的條帶清晰明亮，特異性強(qiáng)，鑒定的性別與實(shí)際性別完全相符。說明本實(shí)驗(yàn)建立的PCR方法準(zhǔn)確可靠，可用于雞早期性別鑒定，在生產(chǎn)和科研上有廣闊的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 CHD ；PCR ；雞 ；性別鑒定

中圖分類號(hào) S836.2

雞的性別與其價(jià)值關(guān)系密切，對(duì)雞進(jìn)行早期性別鑒定具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。生產(chǎn)上常用翻肛鑒別法和伴性性狀鑒別法。翻肛鑒別法必須在出殼后24 h（最好12 h）內(nèi)進(jìn)行，而且即使是經(jīng)驗(yàn)豐富的翻肛員至少也有1.4 %的錯(cuò)誤率，且會(huì)對(duì)雛雞造成傷害[1]。而伴性性狀鑒別法依賴于專門品種或品系之間的雜交，不能通用。隨著分子生物學(xué)等學(xué)科研究的深入，鳥類的性別鑒定已經(jīng)開發(fā)出了PCR方法，可以將鑒定的準(zhǔn)確率提高至100 %，而且不受年齡限制，可以實(shí)現(xiàn)胚胎期的性別鑒定。染色體螺旋蛋白基因（chromobox-helicase-DNA binding gene，CHD）存在于鳥類性染色體Z和W上，Z染色體上的CHD表示為CHD-Z，W染色體上的CHD表示為CHD-W；因?yàn)榇气B的性染色體組成是ZW型，雄鳥的性染色體組成為ZZ型，所以雌鳥中既含有CHD-Z又含有CHD-W，雄鳥中只有CHD-Z；CHD-Z和CHD-W外顯子相似，內(nèi)含子長度不同[2-4]。通過在CHD基因內(nèi)含子兩側(cè)的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，對(duì)樣本基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以CHD-Z和CHD-W為模板擴(kuò)增出的片段長度不同，公雞只能擴(kuò)增出1個(gè)片段，而母雞可以擴(kuò)增出大小不同的2個(gè)片段，根據(jù)PCR產(chǎn)物的數(shù)量和片段大小可以推測個(gè)體的染色體組成，從而判斷性別。

1 材料與方法

1.1 材料

剛出殼的海南儋州本地雞，翼下靜脈刺血，收集于已加入抗凝劑的離心管中，-20 ℃保存?zhèn)溆?。然后解剖記錄每只雞的性別。選取其中的2只公雞和2只母雞的血樣進(jìn)行基因組DNA提取，PCR擴(kuò)增及電泳檢測。

試劑：血液基因組提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，PCR試劑采用全式金super Mix，PCR引物交由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物

選用2550F/2718R[5]和SF/SR[6]兩對(duì)引物分別對(duì)4只雞樣本進(jìn)行PCR性別鑒定。引物序列為：2550F：5′-GTTACTGATTCGTCTACGAGA-3′，2718R：5′-ATTGAAATGATCCAGTGCTTG-3′；SF：5′-AGTGCATTGCAGAAGCAATATT-3′，SR：5′-GCCTCCTGTTTATTATAGAATTCAT-3′。

1.2.2 PCR體系和程序

25 μL體系：模板1 μL，上、下游引物各1 μL，PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)程序：94.0 ℃ 5 min；94.0 ℃ 30 s，54.0 ℃ 30 s，72.0 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；72.0 ℃ 7 min，4 ℃保存。

1.2.3 電泳檢測

吸取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外檢測儀下觀察結(jié)果，并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA

將提取的雞基因組DNA用1.0 %的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。由圖1可知，雞基因組DNA電泳圖呈現(xiàn)致密亮帶，表明所提DNA質(zhì)量良好，可用于PCR擴(kuò)增。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用2550F/2718R和SF/SR兩對(duì)引物分別對(duì)雞基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖2。引物對(duì)2550F/2718R PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為：公雞有1條帶，片段長約600 bp，母雞有2條帶，1條片段長度約600 bp，和公雞相當(dāng)，另一條片段長450 bp。引物對(duì)SF/SR PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為：公雞有1條約500 bp的條帶，母雞有2條帶，1條長度同公雞相當(dāng)，約500 bp，另一條約350 bp。PCR性別鑒定結(jié)果與已知性別完全吻合，條帶清晰明亮，無雜帶，證明兩對(duì)引物都可以特異高效的擴(kuò)增雞Z和W染色體的CHD基因片段，PCR體系配比和PCR所設(shè)條件適宜，所采用的方法可以準(zhǔn)確鑒定雞的性別。

3 討論與結(jié)論

3.1 利用CHD基因性別鑒定

CHD基因存在許多鳥類中，其進(jìn)化速率慢，序列非常保守，已成為非平胸類鳥類性別鑒定的分子標(biāo)記[7]。Griffiths等[2，8]利用CHD基因設(shè)計(jì)引物P2/P3和P2/P8對(duì)約30種鳥類性別進(jìn)行了準(zhǔn)確鑒定；蓋玉林等[9]利用CHD基因和引物P2/P8準(zhǔn)確鑒定了畫眉和紅嘴相思鳥的性別；陳蓉等[10]利用CHD基因和引物2550F/2718R對(duì)美洲紅鹮和火烈鳥的性別進(jìn)行了準(zhǔn)確鑒定；張莉等[11]和呂夕超等[12]分別利用該基因?qū)澴雍托砒澾M(jìn)行了性別鑒定。

3.2 性別的判定

利用CHD基因進(jìn)行性別鑒定，以CHD-Z為模板擴(kuò)增出的條帶稱為Z帶，以CHD-W為模板擴(kuò)增出的條帶為W帶。理論上擴(kuò)增出1條帶說明基因組只含有Z染色體，為公雞，擴(kuò)增出2條帶說明基因組含有Z和W染色體，為母雞，根據(jù)條帶的數(shù)目即可判斷性別。筆者和劉宏祥等[6]研究結(jié)果均發(fā)現(xiàn)：母雞樣本中Z帶和W帶的合成存在競爭關(guān)系，W帶因?yàn)檩^短合成效率較高，更容易擴(kuò)增出來，在模板質(zhì)量不好或者反應(yīng)條件不適宜時(shí)，可能出現(xiàn)母雞基因組擴(kuò)增不出Z帶的情況，所以母雞樣本有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)1條帶的情況。在實(shí)際操作時(shí)，除了通過條帶數(shù)目還應(yīng)該觀察條帶大小進(jìn)行性別判定，如果PCR產(chǎn)物只有W帶，也可判定為母雞。

3.3 PCR法性別鑒定展望

雞作為主要經(jīng)濟(jì)動(dòng)物在畜牧生產(chǎn)中一直占有重要地位，為獲得不同的產(chǎn)品要對(duì)家雞性別做嚴(yán)格的選擇，對(duì)雞胚或雛雞進(jìn)行性別鑒定并分流可大大節(jié)省人力、物力，降低生產(chǎn)成本。除雞以外，家鴿、信鴿、大部分鳥類均可以利用該基因進(jìn)行性別鑒定。PCR方法因?yàn)橹苯訖z測動(dòng)物的分子本質(zhì)，故性別判斷的準(zhǔn)確率高，且對(duì)動(dòng)物的傷害小，不受發(fā)育時(shí)期的限制，優(yōu)勢明顯。特別對(duì)于存在性反轉(zhuǎn)，或者性別分化不明顯的個(gè)體，作為判定的標(biāo)準(zhǔn)更為適宜。隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷改進(jìn)，PCR鑒定方法越來越簡單、經(jīng)濟(jì)、快捷，必將在生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)揮更大的作用。

雞的性別可以利用CHD基因及引物對(duì)2550F/2718R或SR/SF進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。引物對(duì)2550F/2718R判斷標(biāo)準(zhǔn)為：PCR產(chǎn)物有1條約600 bp條帶者為公雞，有600 bp和450 bp兩條帶者為母雞，如果只出現(xiàn)450 bp條帶，也可以判定為母雞。引物對(duì)SF/SR判斷標(biāo)準(zhǔn)為：PCR產(chǎn)物有1條約500 bp的條帶者為公雞，有約500 bp和350 bp兩條帶者為母雞，如果只出現(xiàn)1條約350 bp條帶也可以判定為母雞。兩對(duì)引物擴(kuò)增效率高且特異，所設(shè)條件適宜，本試驗(yàn)方法可以準(zhǔn)確的鑒定雞早期性別，在生產(chǎn)和科研上有廣闊的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)

[1] 王曉峰. 雞胚性別鑒別——家禽科學(xué)研究的新視點(diǎn)[J].中國家禽，2003，25（14）：23-33.

[2] Griffiths R， Tiwari B. Sex of the last wild Spix′s macaw[J]. Nature， 1995， 375（6531）：454.

[3] Griffiths R， Korn R M. A CHD gene is Z chromosome linked in the chicken Gallus domesticus[J].Gene， 1997， 197（1/2）：225-229.

[4] Fridolfsson， Daan S， Dijkstra C. Sex identification in birds using two CHD genes[J]. Proc Biol Sci， 1996， 263（1 374）：1 251-1 256.

[5] Anna K F， Hans E. A simple and universal method for molecular sexing of non-ratite birds[J]. Avian Biology， 1999， 30：116-121.

[6] 劉宏祥，姬改革，胡 艷，等. 基于性染色體CHD基因序列差異鑒定雞的性別[J]. 中國家禽，2013，11（22）：9-10.

[7] Ellegren H. First gene on the avian W chromosome （CHD） provides a tag for universal sexing of non-ratite birds[J]. Proc Royal Soc London B， 1996， 263（1377）：1 635-1 641.

[8] Griffiths R， Double M C， Orr K， et al. A DNA test to sex most birds[J]. Mol Ecol，1998，7（8）：1 071-1 075.

[9] 蓋玉林，路 迪，周材權(quán). 兩種觀賞鳥性別的快速鑒定研究[J]. 西華師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2014，35（2）：166-171.

[10] 陳 蓉，陳 楠，章小小，等. 美洲紅鹮和火烈鳥性別的分子鑒定[J]. 畜牧與獸醫(yī)，2014，46（1）：60-62.

[11] 張 莉，單達(dá)聰，劉 彥，等. 通過CHD基因快速鑒定鴿子性別方法的研究[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2016，43（5）：1 379-1 384.

[12] 呂夕超，葉 超，紀(jì)絲保，等. 通過CHD基因鑒定信鴿性別[J]. 中國畜牧雜志，2015，51（9）：12-15.