李付鵬 秦曉威 郝朝運 閆林 伍寶朵 賴劍雄

摘 要 利用15對SSR引物，分析具有廣泛來源的70份可可資源的遺傳多樣性。結果表明，15對引物共擴增出76個條帶，其中50個多態(tài)性條帶，占總帶數(shù)的65.8%。70份可可資源間遺傳相似系數(shù)（SM）在0.341～0.943之間，平均值為0.625，說明可可資源具有豐富的遺傳多樣性。在相似系數(shù)為0.65水平上，可將70份可可資源分成10類。利用Structure 2.3.2軟件分析群體結構，結合可可果實相關性狀的表型數(shù)據(jù)，采用Tassel 2.1的一般線性模型（General linear model，GLM）進行關聯(lián)分析；結果表明18個位點與果重、果殼重、果長、果徑圍、果殼厚顯著相關（p<0.05），各位點對表型變異貢獻率為5.5%～13.1%。

關鍵詞 可可；SSR；遺傳多樣性；關聯(lián)分析

中圖分類號 S571.3 文獻標識碼 A

Genetic Diversity and Association Analysis of

Cacao Germplasm Using SSR Markers

LI Fupeng1，2，3， QIN Xiaowei1，2，3， HAO Chaoyun1，2，3， YAN Lin1，2，3，

WU Baoduo1，2，3， LAI Jianxiong1，2，3 *

1 Spice and Beverage Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Wanning， Hainan 571533， China

2 Tropical Spice and Beverage Germplasm Repository， Ministry of Agriculture， Wanning， Hainan 571533， China

3 Ministry of Agriculture Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533， China

Abstract Fifteen SSR primers were used to study the genetic diversity among wide original 70 cacao germplasm resources. Seventy-six loci were detected by the 15 primers， of which 50 were polymorphic and its polymorphic ratio was amounted for 65.8%. The genetic similarity was ranged from 0.341 to 0.943 among the accessions， with an average of 0.625. The results indicated that the cacao accessions were rich in genetic diversity. Based on the dendrogram of UPGMA， 70 accessions could be divided into ten groups at the level of 0.65. Based on the analysis of population structure，an association analysis between SSR markers and pod agronomic traits were performed using the Tassel 2.1 GLM（general linear model）program. Of the SSR loci， 18 were significantly associated with pod weight， pod shell weight， pod length， pod equatorial circumference， and pod shell thickness under GLM program， and the ratio of explanation on the phenotype variation of related markers ranged from 5.5%-13.1%.

Key words Theobroma cacao L.； SSR marker； Genetic diversity； Associate analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.02.003

可可（Theobroma cacao L.）與咖啡、茶并稱世界三大飲料作物，全世界熱帶地區(qū)均有栽培[1]。2014年世界可可收獲面積為1.01×107 hm2，總產(chǎn)量4.30×106 t，預計未來種植面積將繼續(xù)擴大[2]?？煽墒侵袊屡d的熱帶特色經(jīng)濟作物，適宜在海南島東南部推廣種植，栽培管理簡單，是典型的“懶人作物”，有巨大的發(fā)展?jié)摿3-4]。

可可以經(jīng)濟利用價值高在世界農(nóng)業(yè)發(fā)展中占有重要地位，種質資源的多樣性一直備受研究人員關注。自Pound[5]首次在亞馬遜河流域開展可可抗病種質資源調查以來，世界可可主產(chǎn)國相繼開展了資源普查與收集工作，現(xiàn)已建立了10多個國家級和3個國際級種質資源保存中心[6]。傳統(tǒng)上，人們依據(jù)地理起源和形態(tài)特征將可可分成Criollo，F(xiàn)orastero和Trinitario（Criollo×Forastero）3大遺傳類群。Motamayor等[7]和Utro等[8]分別利用SSR標記和基因組序列分析可可種質遺傳多樣性，將可可劃分成10大遺傳類群：Amelonado，Contamana，Curaray，Guiana，Iquitos，Maraňón，Nanay，Purús，Criollo和Nacional，為可可種質的遺傳多樣性研究提供了有益參考。

中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院香料飲料研究所從20世紀60年代開始，從世界可可主產(chǎn)區(qū)收集三大類可可遺傳資源近300份?？煽蔀楫惢ㄊ诜郏z傳背景復雜，早期引進的可可種質經(jīng)過自然雜交又創(chuàng)制出大量表型特異的新種質。Hansen等[9]首次將全基因組關聯(lián)分析用于植物后，現(xiàn)已廣泛應用于小麥[10]、馬鈴薯[11-12]、木薯[13]等作物中。國外相繼在可可中開展了關聯(lián)研究，Schnell等[14]以149份可可資源為自然群體，利用46對SSR標記的擴增多態(tài)性與群體材料種苗豐產(chǎn)性進行關聯(lián)，篩選出17個與豐產(chǎn)性顯著相關的位點。Marcano等[15]利用自然群體分析果重和粒重的QTLs，鑒定出5個與果重和粒重性狀關聯(lián)的區(qū)間。但是，關于可可果殼重、果長、果徑圍、果殼厚等性狀與SSR標記關聯(lián)分析少見報道。

為明確中國可可資源遺傳差異，本研究分析了70份可可核心種質遺傳多樣性，明確其遺傳背景，為種質準確鑒定及資源創(chuàng)新提供可靠分子依據(jù)；通過挖掘與果實性狀顯著關聯(lián)的SSR標記，從而為可可等位基因發(fā)掘以及分子標記輔助選擇育種提供一些有意義的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料來自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院香料飲料研究所農(nóng)業(yè)部熱帶香料飲料作物種質資源圃的70份可可資源，其中印尼18份（INA-）、厄瓜多爾7份（ECU-）、馬來西亞7份（MAS-）、泰國6份（THA-）、越南5份（VN-）、委內瑞拉5份（WEN-）、科特迪瓦4份（CIV-）、巴新3份（PNG-）、科摩羅2份（COM-），名稱中有“SBRI-”的13份種質為20世紀60～80年代香飲所在引進基礎上創(chuàng)制的資源，詳見表1。2013年2～4月期間，考察70份可可資源材料的果重/g、果殼重/g、果長/cm、果徑圍/cm、果殼厚/cm表型值。采集供試材料的嫩葉后，在實驗室用液氮速凍研磨，保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取 取出各研磨粉碎的可可葉片樣品，利用基因組DNA提取試劑盒（購自Omega公司，D3471-01）抽提總DNA。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提DNA質量，UV-2310II型紫外可見分光光度計測定DNA濃度，稀釋為20 ng/μL，備用。

1.2.2 SSR引物開發(fā)及遺傳多樣性分析 利用可可產(chǎn)量與品質相關QTLs信息[16-17]，分析可可全基因組（http：//www.cacaogenomedb.org/），在90條系列中獲得65個微衛(wèi)星。采用Primer 5.0軟件設計特異引物，再挑選均勻分布于可可10條連鎖群上的SSR引物53對，由上海生工生物工程公司合成。選用果重、果色、粒重等表型差異較大、不同來源的4份可可（VN-o1、SBRI-e7、PNG-tn13、WEN-ev1），使用Agilent SureCycler 8800 PCR儀進行SSR反應，反應體系為20 μL，包含50 ng模板DNA，10 μmol/L的左右引物各0.5 μL，2 μL Buffer（10×），1.6 μL Mg2+（25 mmol/L），0.2 μL Taq（MBI Fermentas），補ddH2O至20 μL。PCR程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，10個循環(huán)，退火溫度每個循環(huán)下降1 ℃；94 ℃ 45 s，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保溫。PCR反應產(chǎn)物用8%的聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）檢測，電泳在君意東方JY-JX5型電泳儀上進行，時間為90 min，電壓設定為150 V，電泳后銀染顯影。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用人工方法統(tǒng)計引物多態(tài)性，相同遷移位置，清晰度好的擴增條帶賦值“1”，無條帶或肉眼不易分辨的弱帶賦值“0”。利用PopGen32軟件計算Nei's基因多樣性和Shannon信息指數(shù)；用NTSYS-pc2.1軟件，按SAHN鄰接法（neighbor-joining method，NJ）對供試資源進行無權重配對算術平均數(shù)法（Unweighted pair group method using arithmetic averages，UPGMA）遺傳相似性聚類，并繪制樹狀聚類圖。

運用Structure 2.3.2軟件進行群體結構分析，群體數(shù)目K值的取值范圍為2～12，每個K值重復運行10次，參照Evanno等[18]的方法，依據(jù)LnP（D）計算ΔK最小且逐漸趨于穩(wěn)定時的K值，為原始群體的亞群數(shù)，并計算所有材料相應的Q值（第i材料其基因組變異源于第k群體的概率）。采用Tassel 2.1軟件基于一般線性模型（General linear model，GLM）的關聯(lián)分析，將各性狀的表型數(shù)據(jù)對標記逐一進行回歸分析，并計算各標記對表型變異的解釋率。

2 結果與分析

2.1 引物擴增篩選及多態(tài)性

118對SSR引物中，有51對引物能擴增出清晰、易于辨識的條帶，其中15對具有穩(wěn)定的多態(tài)性（圖1）；15對SSR引物在70份資源中共擴增出76個條帶，平均每對引物5.07個；得到50個多態(tài)性條帶，占總帶數(shù)的65.8%，不同引物對揭示的等位基因為2～7個，平均每對引物3.33個（表2）。70份資源的Nei's基因多樣性指數(shù)平均為0.328，Shannon信息指數(shù)平均為0.496?？梢?，上述可可資源遺傳多態(tài)性豐富，也表明其遺傳背景的復雜性與基因的多樣性。

2.2 聚類分析

根據(jù)擴增條帶的數(shù)據(jù)矩陣，分析參試材料間遺傳相似系數(shù)，結果表明，70份可可資源間遺傳相似系數(shù)（SM）介于0.341～0.943之間，平均值為0.625，從分子水平說明參試資源間存在豐富的遺傳差異。其中SBRI-s19與VEN-e12之間的遺傳相似系數(shù)最低（0.341），親緣關系最遠；THA-t16與MAS-tr17之間的遺傳相似系數(shù)最高（0.943），2份種質分別來自泰國和馬來西亞，不僅來源地相近，分子水平上的親緣關系也非常緊密。

綜合SSR引物擴增的50個多態(tài)性位點進行系統(tǒng)聚類分析，得到70份可可資源的聚類分析樹狀圖。從圖2可見，在遺傳相似系數(shù)為0.65水平上可將70份可可資源分成10類。其中SBRI-sv18（B）、VEN-tn5（C）、ECU-sv8（E）分別單獨聚成一類，A、F、G類有2份資源。D類和H類均有17份資源，I類有12份資源，J類有15份資源，各自類群的種質來源地不一，表明可可擴散傳播區(qū)域比較廣泛。D、H、I、J類群資源的果重表型分別為552.51、603.84、584.87、628.75 g，類群間存在一定的差異性。在實踐中，可以有目的地選用不同類群間的種質材料配制雜交組合，一方面可以創(chuàng)制新種質，擴大和豐富可可的遺傳背景，另一方面篩選表型優(yōu)異的株系，培育可可新品種。

2.3 果實性狀與SSR標記關聯(lián)分析

Structure 2.3.2軟件分析表明，LnP（D）值隨假定亞群數(shù)K值的增大而呈現(xiàn)增大趨勢，由圖3可知，在K等于5時，LnP（D）值和ΔK均出現(xiàn)拐點，因此推測該群體材料可被分為5個亞群。

將K=5時，70份材料對應的Q值作為協(xié)變量，基于GLM模型將SSR分子標記變異與果重、果殼重、果長、果徑圍、果殼厚等表型進行回歸分析，尋找關聯(lián)的標記，確定表型變異解釋率。共檢測到18位點與果重、果殼重、果長、果徑圍、果殼厚在p<0.05水平上相關。其中有1個位點與果長形狀的相關性呈極顯著（p<0.01）；其余17個位點中，1個與果重相關，3個與果殼重相關，4個與果長相關，6個與果徑圍相關，3個與果殼厚相關。各位點對表型貢獻率為5.5%～13.1%；對表型貢獻率最大的是mTcCIR391-3（13.1%），它與果長極顯著相關。值得一提的是，mTcCIR554-1標記位點同時與果殼重、果長、果徑圍相關，mTcCIR61-1標記位點同時與果重、果殼重、果徑圍、果殼厚相關（表3）。

3 討論與結論

DNA分子標記技術，可以從根本上揭示不同種質間的遺傳差異，極大方便了種質資源親緣關系研究，有助于提高育種效率。近年來，國外研究人員利用RFLP[19]、SSR[20-21]、SNP[22]等分子標記分析了原產(chǎn)地和主產(chǎn)國可可種質的遺傳多樣性，其中利用SSR標記開展的研究較多。SSR標記能揭示多態(tài)性高且比較穩(wěn)定，本研究利用SSR標記分析了中國收集保存可可種質遺傳多樣性，資源間Nei's基因多樣性指數(shù)平均為0.328，遺傳變異明顯，接近可可原產(chǎn)地的水平[23]。結果表明，中國收集保存的可可資源在分子水平上表現(xiàn)出高度的遺傳差異性，與其在果實和種子性狀表現(xiàn)出豐富的多樣性一致。

可可花結構極為特殊，雄蕊被花瓣囊所包裹，主要依靠蚊蠓、蒼蠅、螞蟻等為其傳粉[24-25]?？煽僧惢ㄊ诜鄹捉Y實[26]，有性生殖后代遺傳背景高度雜合，因此種質間表現(xiàn)出高水平的遺傳多樣性。70份參試資源在遺傳相似系數(shù)為0.65水平上，聚成10類，受限于參試資源的數(shù)量，類群間所包含的資源份數(shù)有較大差異。資源份數(shù)較多的I、J、D、H類群內，其果重和單粒重表型也表現(xiàn)出廣泛的多樣性，也說明可可資源遺傳豐富。先前的研究結果表明，果重與種子產(chǎn)量呈顯著的正相關，但與果實經(jīng)濟系數(shù)呈極顯著負相關；果徑圍、果長均與種子產(chǎn)量呈極顯著的正相關[27]。結合種質的遺傳多樣性和性狀表型，在育種實踐中可以挑選MAS-tr7、MAS-tr18、CIV-f20、SBRI-fv17、ECU-sv8、PNG-tn13等資源作為親本，配制雜交組合，在雜交后代中篩選攜帶雙親優(yōu)良表型的單株，培育新品種。

關聯(lián)分析以自然群體為材料，省去構建作圖群體所需的巨大工作量和時間，目前己發(fā)展成解析作物復雜數(shù)量性狀，繼而發(fā)掘優(yōu)異基因/QTL的有效方法之一。本研究利用15個SSR標記對5個果實相關性狀進行了關聯(lián)分析，共找到18個與果重、果殼重、果長、果徑圍、果殼厚相關的SSR位點，分別位于3、4、6、8、10號染色體。本研究定位的與果重性狀相關的位點mTcCIR61-1位于第10染色體，Marcano等[15]在第10連鎖群上72 cM處定位出一個與果重性狀相關的位點，表型解釋率為10.8%，兩者位置相近。由于中國可可種質均由國外引進，來源廣泛，引進資源多通過種子擴繁，完全了解可可的系譜關系存在相當大的困難，所以本研究對所選資源進行種群結構分析時只能依據(jù)遺傳差異進行分類，各類群種質的地域來源或者地理生態(tài)型不如Motamayor等[7]研究的清晰。以后，可將中國保存的可可資源的分子標記多態(tài)性或基因組序列，與國際上譜系來源清晰的資源進行比對，以明晰中國可可種質傳播路徑與遺傳背景；進而可對自然群體材料進行全基因組SNP位點的關聯(lián)分析，檢測優(yōu)良變異的等位基因，輔助分子設計育種。

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