李運(yùn)合　孫光明　吳青松

摘 要 以菠蘿（Ananas comosus L. cv. Comte de Paris）果實(shí)為材料，采用RT-PCR結(jié)合RACE方法得到3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶基因（命名為AcHMGR）的cDNA及基因組DNA全長(zhǎng)。AcHMGR的cDNA全長(zhǎng)2 407 bp，其開(kāi)放讀碼框長(zhǎng)度為1 740 bp，編碼579個(gè)氨基酸；其基因組DNA全長(zhǎng)為4 115 bp，從起始密碼子到終止密碼子的長(zhǎng)度為3 764 bp，含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。熒光定量PCR結(jié)果表明，對(duì)照的菠蘿果實(shí)中，AcHMGR基因表達(dá)量在花后0 d最高，從花后30 d開(kāi)始，其表達(dá)量急劇下降，之后維持在一個(gè)較低水平直到果實(shí)成熟。經(jīng)20 mg/L N-（2-氯-4-吡啶基）-N'-苯基脲（CPPU）處理后，顯著提高了AcHMGR基因在花后30 d果實(shí)中的相對(duì)表達(dá)量，為同期對(duì)照的1.8倍；但其他時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照相比無(wú)明顯差異。研究結(jié)果表明，AcHMGR基因在菠蘿果實(shí)早期發(fā)育過(guò)程中表達(dá)量較高，CPPU處理提高了AcHMGR基因的相對(duì)表達(dá)量并顯著提高果實(shí)的重量，說(shuō)明CPPU處理后AcHMGR基因可能在促進(jìn)果實(shí)重量的增加中起著重要作用。

關(guān)鍵詞 菠蘿；AcHMGR基因；細(xì)胞分裂；CPPU

中圖分類(lèi)號(hào) S668.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

我國(guó)是世界菠蘿（Ananas comosus L.）生產(chǎn)大國(guó)，主要集中在華南地區(qū)，2012年產(chǎn)量約為100萬(wàn)t，位居世界第8位[1]。但我國(guó)菠蘿平均單產(chǎn)與國(guó)外相比有很大差距，2012年平均單產(chǎn)居世界第27位，只有18 869 kg/hm2，低于世界平均水平，尚不及世界最高單產(chǎn)國(guó)家（124 534 kg/hm2）的1/6[1]。菠蘿果實(shí)為頭狀花序自莖頂端葉叢抽出，發(fā)育而成的聚合果；每個(gè)植株上只有1個(gè)果實(shí)，因此在密度達(dá)到一定程度后，菠蘿單果重（大小）決定了最終產(chǎn)量。果實(shí)的大小是許多作物如菠蘿的一個(gè)重要經(jīng)濟(jì)指標(biāo)，其受內(nèi)部發(fā)育信號(hào)和環(huán)境因素影響[2-4]。菠蘿果實(shí)大小受多種因素調(diào)控，與種植密度、催花時(shí)植株大小、水肥管理等多種因素均密切相關(guān)[5]，最終果實(shí)細(xì)胞數(shù)目、細(xì)胞體積和小果（果眼）數(shù)目共同決定了果實(shí)的最終大小[6]。

3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase， HMGR）催化HMG-CoA產(chǎn)生甲羥戊酸（mevalonic acid， MVA），這是類(lèi)異戊二烯（isoprenoid）生物合成途徑中的關(guān)鍵一步[7-9]；這步反應(yīng)是不可逆的，因此認(rèn)為HMGR是MVA途徑中的一個(gè)限速關(guān)鍵酶[10]。類(lèi)異戊二烯參與了植物的多個(gè)生物進(jìn)程，包括固醇和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（生長(zhǎng)素、脫落酸、赤霉素、油菜素內(nèi)酯）的合成等[11-12]。

前人研究表明，番茄（Solanum lycopersicum）[13]、鱷梨（Persea americana Mill. cv Hass）[11]、荔枝（Litchi chinensis）[14]果實(shí)的早期發(fā)育都有3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMGR）的參與；甜瓜（Cucumis melo L.）HMGR基因（CmHMGR基因）的相對(duì)表達(dá)量和酶活性在授粉后的果實(shí)發(fā)育早期均明顯提高[15]，而過(guò)量表達(dá)CmHMGR基因的轉(zhuǎn)基因甜瓜株系，其果實(shí)重量相比對(duì)照增加了20%[16-17]。這些研究都表明HMGR基因在決定果實(shí)大小中起著重要的作用。另一方面，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上合理使用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑提高作物產(chǎn)量與品質(zhì)已有大量報(bào)道。N-（2-氯-4-吡啶基）-N′-苯基脲[N-（2-chloro-4-pyridyl）-N′-phenylurea， CPPU]是一種人工合成的苯基脲類(lèi)細(xì)胞分裂素，具有促進(jìn)細(xì)胞分裂和增大等多種功能[18-19]。已有的研究表明，在獼猴桃（Actinidia deliciosa C.F. Liang et A.R. Ferguson cv. Qinmei）[20]、甜柿（Diospyros kaki Linn）[21]、日本柿 （Diospyros kaki Thunb.）[22]等多種果樹(shù)的花期或幼果期外施CPPU，均能起到提高果實(shí)重量或改善果實(shí)品質(zhì)的效果；而對(duì)菠蘿外施一定濃度的CPPU，也能顯著提高其果實(shí)重量[23]。本試驗(yàn)以菠蘿果實(shí)為材料，克隆分離了菠蘿AcHMGR基因，并對(duì)其施用CPPU后的表達(dá)模式變化進(jìn)行了研究，以期為研究菠蘿果實(shí)大小的調(diào)控機(jī)制打下一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及CPPU處理

試驗(yàn)于2013年8～11月在廣東省湛江市南亞熱帶作物研究所進(jìn)行，菠蘿品種為皇后類(lèi)的巴厘種（‘Comte de Paris）。CPPU為BBI公司產(chǎn)品，純度>98%；參考李運(yùn)合等[23]的試驗(yàn)結(jié)果，在本試驗(yàn)中的CPPU的使用濃度為20 mg/L。

在菠蘿謝花后15 d和30 d，對(duì)菠蘿果實(shí)噴施20 mg/L的CPPU，以清水為對(duì)照。處理和對(duì)照各150個(gè)果。噴施量以果實(shí)表面有溶液自然下淌為止。

在花后75 d左右，菠蘿果實(shí)成熟，此時(shí)分別測(cè)定90個(gè)對(duì)照及95個(gè)CPPU處理的果實(shí)重量。

1.2 方法

1.2.1 AcHMGR基因的克隆 PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、LA Taq酶、TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.4.0、感受態(tài)細(xì)胞DH5α、dNTP mixture以及克隆載體pMD18-T vector等都購(gòu)于寶生生物工程（大連）有限公司。

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索HMGR基因的氨基酸序列，選擇與菠蘿親緣關(guān)系相對(duì)較近的8個(gè)序列，利用iCODEHOP v1.1程序[24]設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物即AcHMGRSP1和AcHMGRSP2（表1）。取開(kāi)花30 d 后的菠蘿果實(shí)，按照Fu等[25]的方法提取RNA，然后以O(shè)ligo T為引物，參照說(shuō)明書(shū)的方法用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以此cDNA為模板，以AcHMGRSP1和AcHMGRSP2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系及條件參考Li等[26]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

在獲得中間片段后，用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）進(jìn)行5′ RACE和3′ RACE反應(yīng)，獲得其5′和3′末端。反應(yīng)條件參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，所用引物序列見(jiàn)表1及說(shuō)明書(shū)。

用Plant DNAout kit（Tiandz， Beijing， China）提取菠蘿基因組DNA，在通過(guò)RACE方法獲得AcHMGR基因的全長(zhǎng)后，在其5′-UTR和3′-UTR分別設(shè)計(jì)引物，分別以cDNA和基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，分別對(duì)AcHMGR基因cDNA全長(zhǎng)進(jìn)行驗(yàn)證及基因組DNA全長(zhǎng)的獲取。反應(yīng)條件同Li等[26]的方法。

PCR反應(yīng)結(jié)束后，將獲得的目的條帶通過(guò)電泳進(jìn)行分離，用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.4.0進(jìn)行割膠回收純化，將其與pMD18-T Vector連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和雙酶切，挑取陽(yáng)性菌落進(jìn)行培養(yǎng)，送菌液至廣州Invitrogen公司進(jìn)行序列測(cè)定。獲得測(cè)序結(jié)果后通過(guò)GenBank進(jìn)行BLAST搜索對(duì)比。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 核酸序列和其推導(dǎo)的氨基酸序列及開(kāi)放閱讀框（Open reading frame，ORF）通過(guò)NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行在線分析。通過(guò)pI/MW Tool（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）計(jì)算獲得AcHMGR的分子量及等電點(diǎn)。推導(dǎo)的氨基酸序列在NCBI的保守域數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml）進(jìn)行分析來(lái)尋找保守域。通過(guò)ClustalW（http：//www.ebi.ac.uk/clustalw/）對(duì)氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比，將獲得的對(duì)比結(jié)果上傳到BOXSHADE（http：//www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html）進(jìn)行格式整理，之后用MEGA 4.1構(gòu)建HMGR蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3 熒光定量PCR 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析AcHMGR在菠蘿果實(shí)的不同發(fā)育階段的表達(dá)變化。以菠蘿Actin基因[26]作為內(nèi)參（表1）。從開(kāi)花后0 d開(kāi)始，將處理和對(duì)照不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)提取RNA后，用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa Bio Inc.， Dalian， China）對(duì)其反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后儲(chǔ)存于-20 ℃進(jìn)行備用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒為T(mén)hermo Scientific DyNAmo ColorFlash SYBR Green qPCR Kit（Thermo），儀器為Roche LightCyclerR 480II熒光定量PCR儀，反應(yīng)體系及條件參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR中所用引物見(jiàn)表1。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Means±S.E.）表示，對(duì)照與處理之間顯著性差異分析通過(guò)paired-samples t test 進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 CPPU對(duì)菠蘿果實(shí)重量的影響

在花后15 d和30 d分別對(duì)菠蘿果實(shí)噴施20 mg/L的CPPU，對(duì)果實(shí)重量影響明顯。清水對(duì)照單果平均重830.2 g，CPPU處理果實(shí)平均增重11.87%，為928.7 g。這點(diǎn)與前期試驗(yàn)結(jié)果相類(lèi)似，對(duì)花后20 d和35 d的菠蘿果實(shí)，噴施20 mg/L CPPU，果實(shí)增重9.1%[23]，說(shuō)明適宜濃度的CPPU處理，能提高菠蘿果實(shí)的重量。

2.2 AcHMGR的克隆及序列分析

以花后30 d的菠蘿果實(shí)RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，以AcHMGRSP1和AcHMGRSP2（表1）為引物，進(jìn)行PCR后得到1個(gè)長(zhǎng)度為1 259 bp的片段，通過(guò)BLAST分析發(fā)現(xiàn)其屬于植物HMGR基因家族。之后利用RACE方法分別得到此片段的5′和3′末端序列，拼接這些序列后得到了其cDNA全長(zhǎng)，全長(zhǎng)2 407 bp。經(jīng)過(guò)BLAST及進(jìn)化分析，命名為AcHMGR（GenBank登錄號(hào)分別為KM062072），其開(kāi)放讀碼框長(zhǎng)度為1 740 bp，編碼579個(gè)氨基酸，推導(dǎo)的AcHMGR蛋白分子量為60.8 ku，等電點(diǎn)為7.51。

在獲得AcHMGR基因的cDNA全長(zhǎng)后，分別在其3′-UTR和5′-UTR設(shè)計(jì)引物，以提取到的菠蘿基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，獲得AcHMGR的基因組DNA全長(zhǎng)，其長(zhǎng)度為4 115 bp，從起始密碼子到終止密碼子的長(zhǎng)度為3 764 bp（GenBank登錄號(hào)為KX375811）。比較AcHMGR mRNA與其基因組DNA全長(zhǎng)后發(fā)現(xiàn)，從起始密碼子到終止密碼子，AcHMGR含有3個(gè)內(nèi)含子（Intron）和4個(gè)外顯子（Exon），各個(gè)外顯子長(zhǎng)度及位置如圖1所示。

2.3 AcHMGR蛋白結(jié)構(gòu)及序列分析

在NCBI對(duì)AcHMGR序列進(jìn)行Blastx后發(fā)現(xiàn)，其編碼的氨基酸與多種植物的3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase（HMGR）相似度較高，其中AcHMGR與小果野蕉（Musa acuminata，

XP_009387500）、水稻（Oryza sativa Japonica Group，XP_015648250）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon，XP_003572378）、節(jié)節(jié)麥（Aegilops tauschii，EMT29532）、 棕櫚（Elaeis guineensis，XP_010927300）相似度較高，分別為85%、85%、83%、83%、82%。部分氨基酸序列對(duì)比結(jié)果見(jiàn)圖2。

將AcHMGR基因推導(dǎo)的氨基酸序列提交到NCBI的保守域數(shù)據(jù)庫(kù)（Conserved Domain Database，CDD）進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)AcHMGR含有1個(gè)HMG-CoA_

reductase_classI（cd00643）保守域，位于第154-557個(gè)氨基酸（圖3）。

為了確定AcHMGR的系統(tǒng)進(jìn)化位置，通過(guò)搜索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，選取了30個(gè)與AcHMGR蛋白同源性較高的其他植物的HMGR氨基酸序列，用MEGA4.1通過(guò)Neighbor joining（NJ）法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果顯示AcHMGR與小果野蕉（Musa acuminata）、棕櫚（Elaeis guineensis）、砂仁（Amomum villosum）遺傳距離較近（圖4）。

2.4 菠蘿果實(shí)發(fā)育過(guò)程中AcHMGR的表達(dá)變化

對(duì)于對(duì)照的菠蘿果實(shí)，AcHMGR基因的表達(dá)量在花后0 d最高，從花后30 d開(kāi)始，其表達(dá)量急劇下降，只為花后0 d的1/3左右，之后其相對(duì)表達(dá)量不再有明顯變化，直到果實(shí)成熟（圖5）。

20 mg/L的CPPU處理后，顯著提高了AcHMGR基因在花后30 d的果實(shí)中的相對(duì)表達(dá)量（p<0.05），為同期對(duì)照的1.8倍；但其他時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照相比并無(wú)明顯差異（圖5）。

3 討論

本研究從菠蘿果實(shí)中克隆得到了1個(gè)AcHMGR的cDNA及基因組DNA全長(zhǎng)。氨基酸序列多重比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示AcHMGR與EgHMGRR、MaHMGR、AvHMGR有較高的同源性，且具有HMG-CoA_reductase_classI保守域，這些結(jié)果表明，AcHMGR為HMGR家族的同源基因，可能與其他HMGR具有相似的結(jié)構(gòu)和功能。

熒光定量PCR結(jié)果表明，AcHMGR基因在花后0 d的相對(duì)表達(dá)量最高，之后急劇下降，這也與前人的研究相吻合[11，14-15]。荔枝LcHMGR2在花期的0 d的相對(duì)表達(dá)量還較低，但是在花期第7天其表達(dá)量急劇上升，達(dá)到頂峰，然后在花期14 d后其表達(dá)量急劇下降，之后一直維持著一個(gè)較低的表達(dá)水平，兩個(gè)LcHMGR基因都在荔枝果實(shí)早期發(fā)育期間表達(dá)量最高，而這個(gè)時(shí)期是荔枝果實(shí)的細(xì)胞快速分裂期[14]。菠蘿果實(shí)為聚合果，小花開(kāi)放是自下而上，大約持續(xù)半個(gè)月左右， 從開(kāi)花開(kāi)始到花期結(jié)束后30 d，果實(shí)都處于一個(gè)快速的細(xì)胞數(shù)目增長(zhǎng)期[6]，AcHMGR基因在花后0 d的表達(dá)量最高，也說(shuō)明了AcHMGR基因可能與菠蘿果實(shí)細(xì)胞分裂相關(guān)。

本試驗(yàn)中，20 mg/L的CPPU處理顯著提高菠蘿的果實(shí)，但AcHMGR基因只有在花后30 d的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照相比顯著提高，這可能與花后45 d后，菠蘿果實(shí)細(xì)胞分裂已經(jīng)進(jìn)入一個(gè)平臺(tái)期有關(guān)[6]，即CPPU僅能促進(jìn)AcHMGR基因在細(xì)胞快速分裂期的表達(dá)。這意味著可以將CPPU的施用時(shí)間提早到花后0 d甚至剛開(kāi)始開(kāi)花時(shí)，因?yàn)檫@個(gè)時(shí)期菠蘿果實(shí)正處于細(xì)胞快速分裂期[6]，這樣可能更有利于促進(jìn)菠蘿果實(shí)細(xì)胞表達(dá)，從而有可能提高果實(shí)重量。

不同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可能通過(guò)不同的機(jī)制提高果實(shí)重量。前期試驗(yàn)結(jié)果表明，50 mg/L的赤霉素（GA3）顯著提高菠蘿果實(shí)重量，通過(guò)細(xì)胞學(xué)觀察和流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其主要是通過(guò)增大細(xì)胞體積從而提高果實(shí)重量的[27]。而日本柿噴施CPPU后，延長(zhǎng)了薄壁細(xì)胞的膨大期并促進(jìn)了細(xì)胞膨大速率，因此提高了果實(shí)重量[22]。另一方面，CPPU促進(jìn)獼猴桃果實(shí)發(fā)育，其原因可能就是增強(qiáng)了果實(shí)調(diào)運(yùn)光合產(chǎn)物的能力，使細(xì)胞分裂加快和延長(zhǎng)，并促使細(xì)胞膨大[20]。在本實(shí)驗(yàn)中，CPPU處理增加了AcHMGR基因的相對(duì)表達(dá)量，同時(shí)提高了菠蘿果實(shí)重量，這說(shuō)明AcHMGR基因的相對(duì)表達(dá)量可能與菠蘿果實(shí)重量相關(guān)。但CPPU是通過(guò)增大細(xì)胞大小還是提高細(xì)胞數(shù)目的方式從而提高菠蘿果實(shí)重量，尚需在后續(xù)試驗(yàn)中采用組織學(xué)觀察等方法加以確認(rèn)。

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