付蘭蘭　庹德財(cái)　沈文濤　言普　黎小瑛　周鵬

摘 要 弱毒株是利用交叉保護(hù)防治植物病毒病害的關(guān)鍵限制因子。通過(guò)對(duì)馬鈴薯Y病毒屬病毒（強(qiáng)、弱毒株）的全長(zhǎng)及部分氨基酸序列比對(duì)分析，篩選出在親本強(qiáng)毒株P(guān)RSV-LM的P1和HC-Pro基因上的8個(gè)可能與致病性相關(guān)的氨基酸突變位點(diǎn)（I309、K481、K598、R728、F753、L754、N787和D944）。采用定點(diǎn)突變和Gibson拼接法，分別成功構(gòu)建了4種含有2個(gè)突變位點(diǎn)（L754和N787）、4個(gè)突變位點(diǎn)（I309、K481、F753和D944）、6個(gè)突變位點(diǎn)（I309、K481、F753、L754、N787和D944）和8個(gè)突變位點(diǎn)（I309、K481、K598、R728、F753、L754、N787和D944）的PRSV-LM全長(zhǎng)cDNA侵染性克隆突變體：pGprsvm2、pGprsvm4、pGprsvm6和pGprsvm8。經(jīng)人工接種、病癥觀察和RT-PCR檢測(cè)，4種突變體克隆均能系統(tǒng)性侵染非轉(zhuǎn)基因番木瓜植株，除克隆pGprsvm2的病癥表現(xiàn)與親本強(qiáng)毒株P(guān)RSV-LM一致外，其他多位點(diǎn)突變的克隆pGprsvm4、pGprsvm6和pGprsvm8在番木瓜植株上的病癥嚴(yán)重程度出現(xiàn)依次減弱，而克隆pGprsvm8的病癥最弱，且延遲2周發(fā)病。本實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證了6個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)（I309→S、K481→Q、K598→E、F753→L、R728→I和D944→N）與PRSV-LM的病癥表現(xiàn)及致病力相關(guān)，其中K598→E和R728→I可能是影響致病性的關(guān)鍵位點(diǎn)。

關(guān)鍵詞 番木瓜環(huán)斑病毒；弱毒株；定點(diǎn)突變；交叉保護(hù)

中圖分類號(hào) Q949.759.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

番木瓜（Carica papaya L.）又稱木瓜、乳瓜、萬(wàn)壽果，是熱帶、亞熱帶重要的經(jīng)濟(jì)果蔬之一。番木瓜環(huán)斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）屬于馬鈴薯Y病毒科馬鈴薯Y病毒屬病毒，是威脅番木瓜種植產(chǎn)業(yè)發(fā)展最為嚴(yán)重的病害[1]。目前，番木瓜環(huán)斑病還沒(méi)有根治的辦法，僅采取選育抗病新品種，且結(jié)合栽培技術(shù)為主的綜合防治措施。主要從選種耐病品種、改進(jìn)栽培管理措施、消滅傳毒介體、化學(xué)防治、及時(shí)砍除病株、利用弱毒系防治病毒病害及空間避病這些手段進(jìn)行防預(yù)[2]。然而，選育耐病或抗病品種的方法并不理想，栽培管理方面又需耗費(fèi)巨大的人力、財(cái)力和時(shí)間。因此，急需尋求一種環(huán)境友好、高效便捷、應(yīng)用前景廣的防控PRSV的新方法。

交叉保護(hù)（mild strains cross protection， MSCP）是防治植物病毒病為害的一種重要的有效方法，是指一種病毒侵染植株后防止相同病毒的不同株系或親緣關(guān)系相近的另外一種病毒的侵染[3]。McKinney[4]于1929年首次發(fā)現(xiàn)煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）在煙草上存在交叉保護(hù)現(xiàn)象。隨后，交叉保護(hù)作用在植物病毒上有研究報(bào)道，如辣椒輕斑駁病毒（Pepper mild mottle virus，PMMoV）[5]、番茄花葉病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）[6]、番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）[7]、日本山藥花葉病毒（Japanese yam mosaic virus，JYMV）[8]、蘋(píng)果花葉病毒（Apple mosaic virus，ApMV）[9]、李痘病毒（Plum pox virus， PPV）[10]、 花椰菜花葉病毒（Cauliflower mosaic virus， CaMV）[11]、 菜豆黃花葉病毒（Bean yellow mosaic virus， BYMV）[12]、可可腫枝病毒（Cocoa swollen shoot virus， CSSV）[13]、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）[14]、小西葫蘆黃花葉病毒（Zucchini yellow mosaic virus， ZYMV）[15]、柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus， CTV）[16]、 TMV[17]和PRSV[18]等， 目前，已大規(guī)模商業(yè)化應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐的有TMV[19]、 CTV[20-21]、 PRSV[22-23]和ZYMV[15]。

早在20世紀(jì)80年代，利用亞硝酸誘變美國(guó)夏威夷的番木瓜環(huán)斑病毒強(qiáng)毒株HA獲得其弱毒株HA5-1并進(jìn)行交叉保護(hù)防控PRSV研究，在中國(guó)臺(tái)灣和美國(guó)佛羅里達(dá)、夏威夷等地區(qū)得到很好的推廣應(yīng)用[22， 24]。但弱株系的保護(hù)作用存在株系?；詥?wèn)題[25-26]，如HA5-1弱株系對(duì)夏威夷野生株系的保護(hù)作用比對(duì)中國(guó)臺(tái)灣株系的強(qiáng)[27]，對(duì)中國(guó)華南地區(qū)PRSV株系的保護(hù)作用很差[25]，對(duì)泰國(guó)株系和墨西哥株系沒(méi)有保護(hù)作用[26]。進(jìn)一步的研究結(jié)果表明，PRSV株系間的交互保護(hù)作用程度與株系間的親緣關(guān)系呈正相關(guān)[25， 28]。因此，從當(dāng)?shù)氐腜RSV株系中選擇一個(gè)優(yōu)勢(shì)株系進(jìn)行誘變篩選弱株系是一種最佳做法。本研究利用反向遺傳學(xué)技術(shù)對(duì)馬鈴薯Y病毒屬病毒強(qiáng)弱毒株的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，旨在篩選出決定致病性的關(guān)鍵位點(diǎn)，采用定點(diǎn)突變海南PRSV強(qiáng)毒株LM的方法，快速構(gòu)建、篩選病癥顯著減弱的弱毒株，用于后續(xù)交叉保護(hù)效果研究，以期防控危害海南地區(qū)番木瓜種植產(chǎn)業(yè)最為嚴(yán)重的PRSV病毒病。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 PRSV強(qiáng)毒株LM（登錄號(hào)：KT633943）由本實(shí)驗(yàn)室從混合感染的番木瓜樣品中分離、保存，并構(gòu)建其全長(zhǎng)cDNA侵染性克隆pPRSV-LM[29]。非轉(zhuǎn)基因番木瓜（Solo）由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 菌株及載體 大腸桿菌感受態(tài)Trans5α購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；本實(shí)驗(yàn)使用的農(nóng)桿菌C58C1（攜帶pSoup輔助質(zhì)粒）由法國(guó)Thierry Candresse[30]實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；構(gòu)建侵染性克隆的載體pGreenII-35S（登錄號(hào)：KX826944）由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存?？寺≥d體pMD18-T購(gòu)自TaKaRa公司。

1.1.3 主要試劑 高保真酶Prime STAR HS（Premix）、 Premix TaqTM（Ex TaqTM Version 2.0 plus dye）、 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、 TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0、 PrimeScriptTM Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit均購(gòu)自TaKaRa公司； Trizol購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司； Gibson Assembly Master Mix購(gòu)自NEB公司。

1.2 方法

1.2.1 馬鈴薯Y病毒屬病毒強(qiáng)弱毒株氨基酸序列多重比對(duì)分析 本研究共選用33個(gè)馬鈴薯Y病毒屬病毒（強(qiáng)、弱毒株）的全長(zhǎng)或部分氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析（圖1），包括15個(gè)PRSV的分離物和18個(gè)其他馬鈴薯Y病毒屬病毒分離物，其中3個(gè)弱毒株：夏威夷PRSV強(qiáng)毒株HA經(jīng)化學(xué)誘變獲得的弱毒株HA 5-1，法國(guó)從自然界篩選獲得的ZYMV弱毒株WK和日本的BYMV弱毒株M11。使用Vector NTI advance 11軟件進(jìn)行氨基酸序列多重比對(duì)分析。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)合成及測(cè)序 根據(jù)PRSV-LM全長(zhǎng)基因組序列、pGreenII-35S載體序列及8個(gè)突變位點(diǎn)，利用Verctor NTI advance 11軟件，設(shè)計(jì)Gibson拼接法構(gòu)建4種PRSV-LM弱毒突變體的引物（表1），引物合成和測(cè)序均由上海立菲生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.3 亞克隆pMD-M123、pMD-M456和pMD-M1-6的構(gòu)建 用引物對(duì)prsv5F和prsv1011I/S-R、prsv1011I/S-F和prsv1526K/Q-R、prsv1526K/Q-F和prsv2342F/L2345L/I-R、prsv2342F/L2345L/I-F和prsv2445N/S-R、prsv2445N/S-F和prsv2915D/N-R、prsv2915D/N-F和prsv3400R從質(zhì)粒pPRSV-LM上分別擴(kuò)增含突變位點(diǎn)（I309→S、K481→Q、F753→L、L754→I、N787→S和D944→N）的6個(gè)小片段1、2、3、4、5、6。將片段1、2、3和片段4、5、6分別進(jìn)行套疊PCR擴(kuò)增，結(jié)果獲得片段123和片段456，經(jīng)加A處理后分別連接至pMD18-T載體進(jìn)行T-A克隆，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)Trans5α，經(jīng)菌液PCR和測(cè)序鑒定分析，獲得亞克隆pMD-M123和pMD-M456。

用引物對(duì)prsv5F和prsv2342F/L2345L/I-R、prsv2342F/L2345L/I-F和prsv3400R分別從質(zhì)粒pMD-M123和pMD-M456上擴(kuò)增片段123a和片段456a，將片段123a和片段456a進(jìn)行套疊PCR擴(kuò)增獲得片段1-6。同上進(jìn)行T-A克隆，獲得含6個(gè)突變位點(diǎn)的亞克隆pMD-M1-6。

1.2.4 4種PRSV-LM弱毒突變體的構(gòu)建 （1）構(gòu)建弱毒突變體pGprsvm6：用引物prsv5F-25ov和prsv3400R從質(zhì)粒pMD-M1-6上擴(kuò)增片段1-6a；用引物prsv3376F和prsv3R-33T從質(zhì)粒pPRSV-LM上擴(kuò)增PRSV片段B；用引物pGr35S-prsF和pGr35S-R1從質(zhì)粒pGreenII-35S上擴(kuò)增載體片段C，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，膠回收目的片段1-6a、B和C。利用Gibson拼接法[31]將片段1-6a、B和C進(jìn)行體外連接，具體操作參照說(shuō)明書(shū)，然后電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞C58C1（含pSoup輔助質(zhì)粒），涂布含有50 mg/L利福平、50 mg/L卡那霉素和20 mg/L慶大霉素的LB平板，28 ℃條件下倒置培養(yǎng)2～3 d，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，對(duì)初步鑒定出的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的弱毒突變體可用于后續(xù)接種實(shí)驗(yàn)。

（2）構(gòu)建弱毒突變體pGprsvm4：用引物對(duì)prsv5F-25ov、prsv2342F/L-R從質(zhì)粒pMD-M1-6上擴(kuò)增片段P1；分別用引物prsv2342F/L-F、prsv2915D/N-R和prsv2915D/N-F、prsv3R-33T從質(zhì)粒pPRSV-LM上擴(kuò)增片段P2和P3；然后將片段P1和P2進(jìn)行套疊PCR擴(kuò)增片段P12，再將片段P12、P3和載體片段C進(jìn)行Gibson拼接，后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟同1.2.4（1）。

（3）構(gòu)建弱毒突變體pGprsvm2：分別用引物prsv5F-25ov和prsv2345L/I-R、prsv2345L/I-F和prsv2445N/S-R、prsv2445N/S-F和prsv3400R從質(zhì)粒pPRSV-LM上擴(kuò)增片段F1、F2和F3，片段F2和F3套疊PCR擴(kuò)增片段F23，隨后片段F1和F23套疊PCR擴(kuò)增片段F123，再將片段F123、B和載體片段C進(jìn)行Gibson拼接，后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟同1.2.4（1）。

（4）構(gòu)建弱毒突變體pGprsvm8：分別用引物prsv5F-25ov和prsv1877K/E-R、prsv1877K/E-F prsv2268R/I-R、prsv2268R/I-F和prsv3R-33T從質(zhì)粒pGprsvm6上擴(kuò)增片段N1、N2和N3，片段N1和N2套疊PCR擴(kuò)增片段N12，然后將片段N12、N3和載體片段C進(jìn)行Gibson拼接，后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟同1.2.4（1）。

1.2.5 4種弱毒突變體侵染性檢測(cè)及接種后病癥狀況觀察 將構(gòu)建的4種PRSV-LM的弱毒突變體（pGprsvm2、pGprsvm4、pGprsvm6和pGprsvm8）及對(duì)照組（陽(yáng)性對(duì)照CK+為強(qiáng)毒株侵染性克隆pPRSV-LM，陰性對(duì)照CK-為轉(zhuǎn)化空載體pGreenII-35S的農(nóng)桿菌克?。┓謩e接種生長(zhǎng)至20～30 cm的非轉(zhuǎn)基因番木瓜植株上，每組至少接種10株番木瓜苗，進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。農(nóng)桿菌注射接種的方法主要參考Youssef等[30]的方法。

接種后的番木瓜苗在溫室中（25～28 ℃，光照12 h）培養(yǎng)，每周觀察其生長(zhǎng)情況并進(jìn)行拍照。在接種4周后，取第2片或第3片葉（非接種葉片，葉片長(zhǎng)約1 cm為第1片葉）約50 mg，用Trizol法提取番木瓜葉片總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA第一鏈，用PRSV特異引物prsv613-F和prsv613-R（見(jiàn)表1）進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，且對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，從而驗(yàn)證構(gòu)建的4種PRSV-LM的弱毒突變體是否具有侵染性。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯Y病毒屬病毒強(qiáng)弱毒株氨基酸序列的比對(duì)分析

33個(gè)馬鈴薯Y病毒屬病毒強(qiáng)弱毒株之間的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖1，根據(jù)Chiang等[32]的研究結(jié)果顯示，決定PRSV HA5-1為弱毒株的關(guān)鍵位點(diǎn)是全長(zhǎng)氨基酸序列的第309、481、753和944位氨基酸。PRSV弱毒株HA5-1與其他強(qiáng)弱毒株的比對(duì)結(jié)果也表明，第753位氨基酸在馬鈴薯Y病毒屬病毒中是非常保守的，除弱毒株HA5-1和強(qiáng)毒株P(guān)VA（NP_659729）在該位點(diǎn)為亮氨酸（L）外，其他病毒分離物均為苯丙氨酸（F）；第309、481和944位氨基酸雖在馬鈴薯Y病毒屬病毒中不保守，但在PRSV株系中具有較高的保守性。如在第309位，PRSV弱毒株HA5-1為絲氨酸（S），除巴西PRSV強(qiáng)毒株（AKL72309）為亮氨酸（L）外，其他PRSV強(qiáng)毒株的分離物均為異亮氨酸（I）；第481位，夏威夷PRSV強(qiáng)毒株（ABV53466）和弱毒株HA5-1為谷氨酰胺（Q），其他PRSV強(qiáng)毒株分離物均為賴氨酸（K）；在第944位，弱毒株HA5-1為天冬酰胺（N），除海南PRSV分離物（AHG9158）為谷氨酸（E）外，其他PRSV強(qiáng)毒株分離物均為天冬氨酸（D）。由此，將以上4個(gè)氨基酸位點(diǎn)作為弱毒株構(gòu)建的候選突變位點(diǎn)。Gal-On[33]、 Lin等[34]研究結(jié)果表明ZYMV的HC-Pro基因上的FRNK保守結(jié)構(gòu)域中精氨酸（R）突變?yōu)楫惲涟彼幔↖）時(shí)，嚴(yán)重影響其病癥表現(xiàn)。而且本研究比對(duì)結(jié)果也表明，在該位點(diǎn)僅ZYMV弱毒株WK為I，其他病毒分離物均為保守的R，即第728位氨基酸是決定ZYMV WK弱毒株的關(guān)鍵位點(diǎn)，故作為本研究的候選突變位點(diǎn)（圖1）。根據(jù)Nakazono-Nagaoka等[12]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)BYMV弱毒株M11與親本強(qiáng)毒株IbG之間差異的關(guān)鍵位點(diǎn)是第314位氨基酸，結(jié)合比對(duì)分析結(jié)果，選定第754位和第787位氨基酸進(jìn)行候選突變位點(diǎn)。Atreya等[35]、 Huet等[36]報(bào)道TVMV的HC-Pro基因上的KITC保守結(jié)構(gòu)域中賴氨酸（K）突變?yōu)楣劝彼幔‥）時(shí)，會(huì)影響病毒的積累和病癥表現(xiàn)，而且喪失蚜蟲(chóng)傳播的能力。比對(duì)結(jié)果也顯示該位點(diǎn)在馬鈴薯Y病毒屬病毒中也是非常保守的，故第598位氨基酸也作為本研究的突變候選位點(diǎn)。根據(jù)比對(duì)分析選定的以上8個(gè)候選氨基酸突變位點(diǎn)，確定構(gòu)建4種分別含2、4、6、8個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)的PRSV-LM全長(zhǎng)cDNA侵染性克隆突變體。

2.2 亞克隆pMD-M123、pMD-M456和pMD-M1-6的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增獲得含相應(yīng)突變位點(diǎn)的6個(gè)小片段1、2、3、4、5、6（圖2），片段1、2、3和片段4、5、6分別套疊PCR擴(kuò)增得到片段123和片段456（圖2），經(jīng)T-A克隆，成功獲得含突變位點(diǎn)的亞克隆pMD-M123和pMD-M456（圖3-B）。以亞克隆pMD-M123和pMD-M456為模板，PCR擴(kuò)增獲得片段123a和片段456a（圖2），片段123a和片段456a經(jīng)套疊PCR擴(kuò)增得到片段1-6，經(jīng)T-A克隆，成功獲得含6個(gè)突變位點(diǎn)（I309→S、 K481→Q、 F753→L、 L754→I、N787→S和D944→N）的亞克隆pMD-M1-6（圖3-B）。

2.3 4種PRSV-LM的弱毒突變體的構(gòu)建

構(gòu)建弱毒突變體pGprsvm6：PCR擴(kuò)增獲得3個(gè)片段1-6a、B和C（圖4-a），經(jīng)Gibson拼接成功構(gòu)建含6個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變（I309→S、K481→Q、F753→L、L754→I、N787→S和D944→N）的弱毒突變體pGprsvm6（圖3-C）。

構(gòu)建弱毒突變體pGprsvm4：PCR擴(kuò)增獲得片段P1、P2和P3（圖4-b），片段P1和P2經(jīng)套疊PCR擴(kuò)增獲得片段P12，3個(gè)片段P12、P3和C經(jīng)Gibson拼接成功構(gòu)建含4個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變（I309→S、K481→Q、F753→L和D944→N）的弱毒突變體pGprsvm4（圖3-C）。

構(gòu)建弱毒突變體pGprsvm2：PCR擴(kuò)增獲得片段F1、F2和F3（圖4-c），片段F2和F3經(jīng)套疊PCR擴(kuò)增得到片段F23，然后片段F1和F23經(jīng)套疊PCR擴(kuò)增得到片段F123，3個(gè)片段F123、B和C經(jīng)Gibson拼接成功構(gòu)建含2個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變（L754→I和N787→S）的弱毒突變體pGprsvm2（圖3-C）。

構(gòu)建弱毒突變體pGprsvm8：PCR擴(kuò)增獲得片段N1、N2和N3（圖4-d），片段N1和N2經(jīng)套疊PCR擴(kuò)增獲得片段N12，3個(gè)片段N12、N3和C經(jīng)Gibson拼接成功構(gòu)建含8個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變（I309、K481、K598、R728、F753、L754、N787和D944）弱毒突變體pGprsvm8（圖3-C）。

2.4 4種PRSV-LM的弱毒突變體接種番木瓜后的侵染性檢測(cè)及病癥表現(xiàn)分析

接種4周后，對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的非接種新生葉片進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，4種弱毒突變體和陽(yáng)性對(duì)照組均能檢測(cè)出613 bp目的條帶（圖5），且PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果正確。結(jié)果表明：4種弱毒突變體pGprsvm2、pGprsvm4、pGprsvm6、pGprsvm8和陽(yáng)性對(duì)照組pPRSV-LM均能系統(tǒng)性侵染番木瓜植株，且侵染效率達(dá)100%，而陰性對(duì)照組pGreenII-35S不能侵染番木瓜（圖3-C）。

各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在接種3周后，在番木瓜植株上無(wú)明顯病癥發(fā)生。陽(yáng)性對(duì)照組pPRSV-LM和含2個(gè)位點(diǎn)突變的弱毒突變體pGprsvm2在接種番木瓜苗4周后，植株開(kāi)始表現(xiàn)出輕微的葉脈褪綠、透化，葉片黃化，莖桿出現(xiàn)水漬等病癥，隨后病癥逐漸加重，接種6周后葉片出現(xiàn)皺縮、畸形，至第10周時(shí)，葉片嚴(yán)重畸形，植株開(kāi)始出現(xiàn)停滯生長(zhǎng)，甚至無(wú)法長(zhǎng)出新葉（圖6）。含4個(gè)位點(diǎn)突變的弱毒突變體pGprsvm4和含6個(gè)位點(diǎn)突變的弱毒突變體pGprsvm6在接種4周后，也開(kāi)始出現(xiàn)輕微病癥，直至第10周，僅出現(xiàn)花葉、葉片局部畸形、莖桿少量水漬狀等，均表現(xiàn)出較陽(yáng)性對(duì)照組輕微的病癥，且弱毒突變體pGprsvm6表現(xiàn)的病癥要比弱毒突變體pGprsvm4的弱（圖6）。含8個(gè)位點(diǎn)突變的弱毒突變體pGprsvm8僅在接種8周后才出現(xiàn)葉脈輕度透化、葉片輕微褪綠、莖桿無(wú)明顯水漬狀等，直至第10周，病癥也未出現(xiàn)加重，長(zhǎng)勢(shì)較好，基本不影響生長(zhǎng)，其病癥表現(xiàn)比弱毒突變體pGprsvm6弱很多（圖6）。而接種空載體pGreenII-35S的陰性對(duì)照組在接種10周后仍健康生長(zhǎng)，無(wú)任何病癥表現(xiàn)（圖6）。經(jīng)過(guò)接種后10周的觀察，發(fā)現(xiàn)弱毒突變體pGprsvm2和陽(yáng)性對(duì)照組親本毒株pPRSV-LM的病癥相當(dāng)，最為嚴(yán)重；弱毒突變體pGprsvm4次之，病癥較弱；弱毒突變體pGprsvm6再次之，病癥很弱；弱毒突變體pGprsvm8會(huì)延遲發(fā)病，且病癥最弱，癥狀不明顯；接種空載體pGreenII-35S的陰性對(duì)照組無(wú)任何病癥表現(xiàn)（圖6）。

2.5 影響PRSV-LM致病性的相關(guān)位點(diǎn)分析

本研究4種PRSV-LM的弱毒突變體（pGprsvm2、pGprsvm4、pGprsvm6和pGprsvm8）接種番木瓜的病癥發(fā)生結(jié)果顯示：除含L754→I和N787→S兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變的弱毒突變體pGprsvm2發(fā)病情況與親本強(qiáng)毒株P(guān)RSV-LM相似外，其他多位點(diǎn)突變的弱毒突變體pGprsvm4、pGprsvm6和pGprsvm8在番木瓜植株上癥狀都有不同程度的減弱，而弱毒突變體pGprsvm8的病癥最弱，且可延遲2周發(fā)病。初步說(shuō)明I309→S、K481→Q、K598→E、F753→L、R728→I和D944→N這6個(gè)氨基酸位點(diǎn)的改變與PRSV-LM的病癥表現(xiàn)及致病力相關(guān)，其中K598→E和R728→I兩個(gè)位點(diǎn)對(duì)其致病力的影響是至關(guān)重要的，而L754→I和N787→S兩個(gè)位點(diǎn)的改變對(duì)其病癥表現(xiàn)影響不顯著。

3 討論

3.1 PRSV-LM毒力弱化的相關(guān)位點(diǎn)分析

4種PRSV-LM的弱毒突變體接種番木瓜苗后10周的病癥觀察顯示，含L754→I和N787→S兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變的弱毒突變體pGprsvm2仍表現(xiàn)出與親本強(qiáng)毒株P(guān)RSV-LM類似的癥狀，可見(jiàn)L754和N787兩個(gè)位點(diǎn)的氨基酸的改變不影響病癥表現(xiàn)。含I309→S、K481→Q、F753→L和D944→N這4個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變的弱毒突變體pGprsvm4在番木瓜植株上的癥狀明顯減弱，該結(jié)果驗(yàn)證了Chiang等[32]的報(bào)道，決定PRSV弱毒株HA5-1是位于P1和HC-Pro基因上的第309、481、753和944位氨基酸。本實(shí)驗(yàn)中含8個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變的克隆pGprsvm8比含6或4個(gè)位點(diǎn)突變的弱毒突變體pGprsvm6和pGprsvm4的病癥顯著減弱，且延遲發(fā)病，表明K598→E和R728→I的突變對(duì)PRSV-LM的致病性有重大影響。這與Gal-On[33]、 Lin等[34的研究結(jié)果一致，發(fā)現(xiàn)決定ZYMV弱毒株WK的關(guān)鍵位點(diǎn)是HC-Pro蛋白中第180位精氨酸突變?yōu)楫惲涟彼酭180→I（對(duì)應(yīng)于PRSV全長(zhǎng)氨基酸序列的第728位氨基酸R728→I）。由于該位點(diǎn)正位于保守結(jié)構(gòu)FRNK上，第728位精氨酸在馬鈴薯Y病毒屬病毒中高度保守（圖1），故該位點(diǎn)的突變對(duì)PRSV至關(guān)重要。Atreya等[35]、 Huet等[36]發(fā)現(xiàn)TVMV的第307位賴氨酸突變?yōu)楣劝彼幔▽?duì)應(yīng)于PRSV全長(zhǎng)氨基酸序列的第598位氨基酸K598→E）時(shí)，會(huì)影響病毒的積累和病癥表現(xiàn)，而且喪失蚜蟲(chóng)傳播的能力。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，K598正位于保守結(jié)構(gòu)域KITC上，在馬鈴薯Y病毒屬病毒中具有較高保守性。雖然含K598→E和R728→I突變的克隆pGprsvm8不能分別證明這2個(gè)位點(diǎn)對(duì)其致病性的影響，但也驗(yàn)證了K598和R728是決定PRSV-LM致病性和病癥表現(xiàn)的關(guān)鍵位點(diǎn)。此外，K598→E該位點(diǎn)的突變是否影響蚜蟲(chóng)傳播能力有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，這將為后續(xù)弱毒株的交叉保護(hù)應(yīng)用具有重要意義。

3.2 交叉保護(hù)弱毒株的獲取及應(yīng)用

利用交叉保護(hù)防治植物病毒病害最關(guān)鍵的是弱毒株的獲得。目前，弱毒株的獲得通常有以下幾種途徑： （1）從自然界中篩選，如在病毒危害嚴(yán)重的田間植株中篩選獲得[37]；（2）通過(guò)化學(xué)和物理方法誘變，如用亞硝酸鹽[38]和紫外線直接處理強(qiáng)毒病毒獲得； （3）通過(guò)溫度誘變獲得[39]；（4）通過(guò)反向遺傳學(xué)技術(shù)獲得[40]。

隨著對(duì)病毒致病機(jī)理的深入研究，利用反向遺傳學(xué)技術(shù)在明確調(diào)控病毒致病性的氨基酸位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)定點(diǎn)突變的方法構(gòu)建病毒全長(zhǎng)侵染性克隆突變體，篩選獲得病癥顯著減弱的弱毒株系，這比從自然界中篩選或是物理化學(xué)因素誘變后篩選更為簡(jiǎn)單有效。也有研究結(jié)果表明，對(duì)特定的某個(gè)位點(diǎn)的核苷酸進(jìn)行突變后，發(fā)生回復(fù)突變、恢復(fù)原有致病力的幾率很小[34]，從而大大降低了弱毒株在應(yīng)用交叉保護(hù)過(guò)程中突變?yōu)閺?qiáng)毒株的風(fēng)險(xiǎn)。雖然弱毒株的交叉保護(hù)作用也存在一些缺陷，如交叉保護(hù)存在的株系?；詥?wèn)題[28]、作物和品種問(wèn)題[41]、弱毒株系與其他病毒有協(xié)生作用的風(fēng)險(xiǎn)[42]。但相比轉(zhuǎn)基因、藥物防治及栽培管理防治，植物病毒的交叉保護(hù)作用具有多抗、高抗和衛(wèi)生安全等優(yōu)點(diǎn)，防治效果更為有效。因此，本研究選擇PRSV弱毒株的獲取途徑是利用反向遺傳學(xué)技術(shù)，對(duì)與PRSV-LM毒力弱化的相關(guān)位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，從而構(gòu)建了4種PRSV的弱毒突變體。

在構(gòu)建的4種PRSV弱毒突變體克隆中，弱毒突變體pGprsvm8侵染的木瓜苗經(jīng)過(guò)10周的病癥觀察發(fā)現(xiàn)未出現(xiàn)明顯的病癥，長(zhǎng)勢(shì)與陰性對(duì)照組相近，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)出弱毒突變體pGprsvm8能夠系統(tǒng)的感染番木瓜，并控溫25 ℃的條件下觀察弱毒株的病癥狀況，避免了病毒高溫隱癥所帶來(lái)的誤導(dǎo)[43]。本研究構(gòu)建的弱毒突變體pGprsvm8可作為理想型的弱毒株用于后續(xù)的交叉保護(hù)實(shí)驗(yàn)，為后續(xù)交叉保護(hù)實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為其他馬鈴薯Y病毒屬病毒弱毒株的構(gòu)建提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

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