陳奕鵬　霍姍姍　時(shí)濤　李超萍　楊揚(yáng)　蔡吉苗　黃貴修

摘 要 以木薯細(xì)菌性萎蔫病病菌為靶標(biāo)，從健康木薯組織中分離獲得一株有較好抑菌作用的內(nèi)生細(xì)菌。生理生化測定、形態(tài)觀察及16S rDNA序列分析表明其為類芽孢桿菌屬。拮抗試驗(yàn)表明該菌株對木薯細(xì)菌性萎蔫病菌、疫霉根腐病菌、棒孢霉葉斑病菌和膠孢炭疽病菌均有較強(qiáng)的抑制作用。田間防控試驗(yàn)表明該菌株對木薯細(xì)菌性萎蔫病有較好的防治效果，具有良好的開發(fā)前景。

關(guān)鍵詞 木薯；拮抗內(nèi)生細(xì)菌；類芽孢桿菌屬

中圖分類號 S435.33 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

木薯（Manihot esculenta Crantz）為大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬灌木狀多年生作物，是和馬鈴薯、甘薯并稱的三大薯類作物之一，是世界上10億人口日常生活中所需熱能的主要來源。木薯塊根富含淀粉，在糧食、飼料加工、工業(yè)原材料等方面均有廣泛的用途[1]。木薯適應(yīng)性強(qiáng)，耐旱耐瘠，主要分布在中南美洲、非洲、東南亞等熱帶地區(qū)和部分亞熱帶地區(qū)。我國木薯主產(chǎn)區(qū)集中在廣西、廣東、海南、云南和福建5個(gè)省（區(qū)），湖南、四川、貴州和江西等省也有少量栽培[2]。近年來，我國一直是世界上最大的木薯進(jìn)口國[3]，國內(nèi)木薯生產(chǎn)對相關(guān)產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

和其它作物類似，各類嚴(yán)重發(fā)生的病害是木薯相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的限制性因素之一。細(xì)菌性萎蔫病，也稱細(xì)菌性枯萎病，是國內(nèi)木薯生產(chǎn)中危害最為嚴(yán)重的病害，可造成30%以上的產(chǎn)量損失[4]。疫霉根腐病、棒孢霉葉斑病和炭疽病也是我國木薯中的常見病害[5-7]。目前，國內(nèi)對于木薯病害的防控主要依靠化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治，成本高且污染環(huán)境。生物防治是未來木薯病害防控技術(shù)研究的主要方向，但相關(guān)研究還很少，特別是木薯內(nèi)源拮抗微生物篩選方面尚無相關(guān)研究。筆者們在前期研究基礎(chǔ)上，開展了木薯拮抗內(nèi)生菌的分離篩選和鑒定工作，獲得了一株對主要木薯病害病原菌有較強(qiáng)拮抗能力的內(nèi)生細(xì)菌，本文為主要研究結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 木薯組織樣品和病原菌菌株 健康木薯品種華南5號葉片樣品來自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所儋州試驗(yàn)基地。木薯細(xì)菌性萎蔫病菌（Xanthomonas axonopodis pv. manihotis）菌株GX11、木薯疫霉根腐病菌（Phytophthora palmivora）菌株CPPHN01、棒孢霉葉斑病菌（Corynespora cassiicola）菌株CCCHN01、膠孢炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）菌株CCGHN01、大腸桿菌（Escherichia coli）菌株JM019、多粘類芽孢桿菌（P. polymyxa）菌株ATCC 842T均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基和試劑 病原真菌菌株培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基，細(xì)菌培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基，配方參見《植病研究方法》[8]；DNA片段回收試劑盒和pMD18-T載體購買自寶生物工程（大連）有限公司；Taq酶、dNTP和大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞購買自天根生化科技（北京）有限公司；引物799F（59-AACAGGATTAGATACCCTG-3′）和1492R（5′-TACG

GCTACCTTGTTACGAGTT-3′），由北京六合華大基因科技股份有限公司合成；其它試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離和篩選 參照付業(yè)勤等[9]的方法，對木薯葉片樣品進(jìn)行表面消毒后進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌的分離和純化。菌株的篩選參照潘羨心等[10]的對峙培養(yǎng)法，用木薯細(xì)菌性萎蔫病菌作為靶標(biāo)菌。

1.2.2 內(nèi)生細(xì)菌抑菌作用評價(jià) 菌株對木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的抑制作用采用牛津杯法進(jìn)行。將木薯細(xì)菌性萎蔫病菌培養(yǎng)至OD600約0.6，按照1 ∶ 20的比例將菌液與滅菌后冷卻至45 ℃的NA培養(yǎng)基混勻后制備帶菌平板。參照潘羨心[10]的方法，制備內(nèi)生細(xì)菌的無菌濾液，將牛津杯放置在帶菌平板的中央，加入0.2 mL的濾液，以液體NA培養(yǎng)基為對照，重復(fù)3次。28 ℃培養(yǎng)2 d后觀察抑菌情況，測量抑菌圈直徑。

采用對峙培養(yǎng)法評價(jià)內(nèi)生細(xì)菌對木薯疫霉根腐病菌、棒孢霉葉斑病菌和膠胞炭疽菌的抑菌作用。將病原菌菌餅接種在PDA平板的中央，將內(nèi)生細(xì)菌在菌餅兩側(cè)約3 cm處進(jìn)行劃線接種，28 劃培養(yǎng)7 d后，測量菌落直徑，計(jì)算菌落生長抑制率。

1.2.3 內(nèi)生細(xì)菌菌株鑒定 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[11]和《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》[12]觀察菌株CEB33的培養(yǎng)形態(tài)、性狀、革蘭氏染色反應(yīng)，同時(shí)測定菌株的生理生化特征。參照潘羨心[13]的方法進(jìn)行菌株16S rDNA序列的測定和分析。從數(shù)據(jù)庫中下載近源物種的16S rDNA序列，應(yīng)用MEGA version 4.0中的NJ（Neighbor-Joining）方法生成系統(tǒng)樹，用Bootstrap 對系統(tǒng)樹進(jìn)行檢驗(yàn)，1 000次重復(fù)。

1.2.4 內(nèi)生細(xì)菌內(nèi)生性測定 參照陳博[14]的方法，用含有氨芐青霉素的液體NA培養(yǎng)基對內(nèi)生細(xì)菌菌株進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，最終獲得對氨芐青霉素具抗性的突變菌株。用針刺法將抗性標(biāo)記菌株接種在木薯華南5號植株的健康葉片上，分別用大腸桿菌菌株JM019和無菌水做對照。28 ℃培養(yǎng)5 d后，取距離接種針刺點(diǎn)約1 cm的葉片組織，參照1.2.1的方法進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌的分離和鑒定。

1.2.5 內(nèi)生細(xì)菌對木薯細(xì)菌性萎蔫病的田間防控試驗(yàn)

選擇地勢平坦，土質(zhì)疏松，土壤肥力中等，上一茬種植木薯且細(xì)菌性萎蔫病發(fā)生較嚴(yán)重的田塊進(jìn)行。供試木薯品種為華南9號。試驗(yàn)共設(shè)3個(gè)處理和1個(gè)空白對照：CEB33菌液（OD600 0.6）、可殺得叁千（46%氫氧化銅WDG，美國杜邦公司生產(chǎn)，稀釋1 500倍）、凈剎（80%乙蒜素EC，河南科邦化工有限公司生產(chǎn)，稀釋3 000倍）及空白對照（清水），每個(gè)處理重復(fù)3次，共12個(gè)小區(qū)，小區(qū)面積100 m2，小區(qū)間設(shè)3行保護(hù)行，木薯行距100 cm，株距60 cm。

參照盧昕等[15]的方法進(jìn)行藥劑防效的評價(jià)。采用五點(diǎn)取樣法對各個(gè)處理小區(qū)進(jìn)行調(diào)查，每個(gè)小區(qū)調(diào)查5個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)3株木薯，共15株；在每株木薯的上、中、下部不同部位各取5張復(fù)葉，共取復(fù)葉15張。按照以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級：0級：無任何病斑；1級：病斑總面積占葉片總面積1/16以下；3級：病斑總面積占葉片總面積1/16～1/8；5級：病斑總面積占葉片總面積1/8～1/4；7級：病斑總面積占葉片總面積1/4～1/2；9級：病斑總面積占葉片總面積1/2以上或葉片變黃凋萎。按照以下公式計(jì)算各小區(qū)的病情指數(shù)，計(jì)算病害減退率，求取校正防效的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，用SAS9.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析[16]。

病情指數(shù)=（Σ各病級葉片數(shù)×相應(yīng)病級數(shù)值）/（調(diào)查總?cè)~片數(shù)×最高病害級數(shù)）×100

病害減退率=（防治前病情指數(shù)-防治后病情指數(shù)）/防治前病情指數(shù)×100%

校正防效=（各處理病害減退率-對照病害減退率）/（100-對照病害減退率）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 木薯內(nèi)生細(xì)菌的分離與篩選

本研究從健康木薯葉片中共獲得細(xì)菌分離物12株，從中篩選出3株對木薯細(xì)菌性萎蔫病病菌有較好拮抗作用的菌株，其中1株菌株的抑菌帶最寬，命名為CEB33。

2.2 CEB33的抑菌作用評價(jià)

研究發(fā)現(xiàn)CEB33對木薯細(xì)菌性萎蔫病菌有較好的抑菌作用，抑菌圈直徑為17 mm（圖1）。CEB33對木薯疫霉根腐病菌、棒孢霉葉斑病菌和炭疽病菌的抑菌率分別為60.7%、63.2%和43.9%（圖2、3和4）。

2.3 CEB33菌株的鑒定

CEB33在NA平板上的菌落呈乳白色，形狀不規(guī)則，表面光滑，且粘稠程度高，邊緣有較高隆起。菌體短桿狀近球形，有莢膜，大小為（0.6～0.8）μm×（1.0～1.2）μm，革蘭氏染色為陰性，能產(chǎn)生橢圓形芽孢。菌株的生理生化特征測定結(jié)果見表1。

提取CEB33菌株的基因組DNA，用引物對799F和1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增后獲得約0.7 kb的擴(kuò)增產(chǎn)物。該片段克隆測序后，確認(rèn)其全長為738 nt，堿基序列相似性比對發(fā)現(xiàn)其與類芽孢桿菌菌株CR1（登錄號CP006941.2）、菌株AM49（登錄號NR 025169.1）等的序列同源性為99%。該序列已提交NCBI 數(shù)據(jù)庫，登錄號為KX822134。從數(shù)據(jù)庫中下載類芽孢桿菌屬14個(gè)菌株的16S rDNA序列，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）。結(jié)果顯示，該菌株與P. kribbensis AM49（NR025169）聚為一個(gè)分枝，和P.peoriae、P. polymyxa等親緣關(guān)系最近，與類芽胞桿菌屬其它種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。菌株形態(tài)觀察、生理生化特征鑒定和16S rDNA 序列聚類分析結(jié)果表明該菌株為類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）細(xì)菌。

2.4 CEB33菌株內(nèi)生性的鑒定

用含有低濃度氨芐青霉素的液體NA培養(yǎng)基進(jìn)行CEB33的誘導(dǎo)培養(yǎng)，逐步增加氨芐青霉素的濃度，最終獲得能在含有濃度為300 μg/mL氨芐青霉素的培養(yǎng)基上穩(wěn)定生長、且菌落形態(tài)及對病原菌的拮抗作用等均保持不變的抗性菌株，命名為CEB33-amp。該菌株接種木薯葉片后，重新分離獲得了培養(yǎng)性狀等特性和CEB33-amp完全一致的培養(yǎng)物，而大腸桿菌和無菌水等對照處理均未分離到類似的抗性細(xì)菌。

2.5 CEB33對木薯萎蔫病菌的田間防效評價(jià)

2015年，在海南省文昌市邁號鎮(zhèn)進(jìn)行了CEB33對木薯萎蔫病的防效試驗(yàn)，3次施藥時(shí)間分別為8月26日、9月5日和9月15日。9月25日調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)3個(gè)處理均無藥害產(chǎn)生。其中CEB33的校正防效為55.0%，優(yōu)于氫氧化銅（校正防效37.0%），但差于乙蒜素（校正防效73.0%）（表2）。

3 討論

本研究經(jīng)過嚴(yán)格的表面消毒，從健康木薯葉片中分離篩選到一株具有良好拮抗效果的內(nèi)生細(xì)菌菌株CEB33，經(jīng)形態(tài)觀察、基礎(chǔ)生理生化特性測定及16S rDNA序列分析，鑒定其為類芽孢桿菌。該菌株對木薯常見病害病原菌均有較好的拮抗作用，田間施用發(fā)現(xiàn)其對木薯萎蔫病菌有較好的防效，表明該菌株在木薯病害防控中有良好的應(yīng)用前景。

植物內(nèi)生細(xì)菌是指整個(gè)生活史或其部分階段能夠進(jìn)入活體植物組織內(nèi)，且它們的存在并未使植物組織的表型特征和功能有明顯改變的細(xì)菌。和病原細(xì)菌不同，內(nèi)生細(xì)菌和宿主植物之間是一種共生關(guān)系。宿主植物能夠?yàn)樯纼?nèi)生細(xì)菌提供生存空間、水份和養(yǎng)分，保護(hù)其不受外界環(huán)境的影響，和常規(guī)生防相比具有更好的防效穩(wěn)定性。內(nèi)生細(xì)菌還可作為外源基因的載體應(yīng)用于生產(chǎn)，因此拮抗性內(nèi)生細(xì)菌的研究是近年來生防研究中的熱點(diǎn)。目前研究者幾乎從所有已知的植物中都分離得到了內(nèi)生細(xì)菌，本研究也發(fā)現(xiàn)健康的木薯組織中同樣存在著對病原菌有拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌。

類芽孢桿菌屬細(xì)菌具有生長快、營養(yǎng)簡單、能夠形成具較強(qiáng)抗逆能力的芽孢、性能穩(wěn)定等優(yōu)勢，是田間生產(chǎn)中應(yīng)用潛力較大的一類菌株[17]。該類生防菌株對水稻紋枯病菌[18]、番茄早疫病菌[19]等病原真菌，番茄青枯病菌[20]等病原細(xì)菌均有較好的拮抗作用。目前生防類芽孢桿菌作用機(jī)制方面的研究，主要集中在分泌抗菌蛋白（抗菌蛋白、肽類、胞外多糖等）、與病菌競爭生態(tài)位和營養(yǎng)，以及誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生系統(tǒng)性抗性等方面[21-23]。CEB33對木薯主要病害病原菌的抑菌作用機(jī)理將是筆者們下一步研究工作的重點(diǎn)。

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