伍慧雄 秦楷 張偉豪 羅元嘉 孫朝輝 王軍 單體江

摘要：【目的】分析和鑒定長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條揮發(fā)油的化學(xué)組成，測(cè)定長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條揮發(fā)油及其甲醇提取物對(duì)7種供試細(xì)菌的抑制活性，為長(zhǎng)葉竹柏資源的開(kāi)發(fā)利用提供參考?！痉椒ā坎捎盟魵庹麴s法分別提取長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條的揮發(fā)油，通過(guò)氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）對(duì)提取得到的揮發(fā)油進(jìn)行化學(xué)成分分析，采用峰面積歸一化法測(cè)定各化學(xué)成分的相對(duì)百分含量，并以抑菌圈法和薄層層析—生物自顯影法分別測(cè)定長(zhǎng)葉竹柏枝葉揮發(fā)油和甲醇提取物對(duì)供試細(xì)菌的抑制活性?！窘Y(jié)果】長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條揮發(fā)油的得率分別為0.104%和0.078%。從長(zhǎng)葉竹柏葉片揮發(fā)油中鑒定出45種成分，占揮發(fā)性成分總量的92.63%，主要成分為（1R）-α-蒎烯（34.50%）、大根香葉烯B（22.82%）、大根香葉烯D（5.46%）、綠花烯（4.74%）和α-古蕓烯（3.15%）；從長(zhǎng)葉竹柏枝條揮發(fā)油中鑒定出44種成分，占揮發(fā)性成分總量的95.51%，主要成分為（1R）-α-蒎烯（43.86%）、δ-杜松烯（7.93%）、1-石竹烯（4.92%）、（3aS，3bR，4S，7R，7aR）-7-methyl-3-methylidene-4-（propan-2-yl）octahydro-1H-cyclopenta[1，3]cyclopropa[1，2]benzene（4.91%）、2-isopropyl-5-methyl-9-methylene[4.4.0]dec-1-ene（3.72%）、古巴烯（3.68%）、γ-杜松烯（3.60%）和蒜頭環(huán)烯（3.04%）。長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條揮發(fā)油對(duì)供試細(xì)菌表現(xiàn)出一定的抑制活性，但差異不明顯；長(zhǎng)葉竹柏葉片揮發(fā)油對(duì)根癌土壤桿菌的抑制活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為9.0±0.0 mm，而枝條揮發(fā)油對(duì)溶血葡萄球菌和黃瓜角斑病菌的抑制活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑均為8.3±0.6 mm。除桉樹(shù)青枯病菌外，長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條甲醇提取物對(duì)其余6種供試細(xì)菌均表現(xiàn)出較好的抑制活性，其中葉片甲醇提取物對(duì)供試細(xì)菌的抑制活性強(qiáng)于枝條?！窘Y(jié)論】長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條中的抗菌活性物質(zhì)主要為非揮發(fā)性的物質(zhì)，可作為天然抗菌活性物質(zhì)資源開(kāi)發(fā)利用。

關(guān)鍵詞： 長(zhǎng)葉竹柏；揮發(fā)油；化學(xué)成分；GC-MS；抗菌活性

中圖分類號(hào)： S482.2；S791.46 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）11-1867-08

Abstract：【Objective】The present study was conducted to analyze and identify the chemical composition of the volatile oils extracted in leaves and branches of Podocarpus fleuryi Hickel. The antibacterial activities of the volatile oils and methanol extracts were tested against seven different bacteria. This study would provide the potential foundation for the development and utilization of P. fleuryi resources. 【Method】The volatile oils were extracted by hydro-distillation from leaves and branches of P. fleuryi and the chemical compositions of the essential oil were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）. The relative percentages of different chemical components were measured by peak area normalization. Inhibition zone method and TLC-MTT-bioautography were used to detect the inhibitory activities of volatile oils extracted from leaves and branches of P. fleuryi and methanol extracts against the tested bacteria. 【Result】The yields of volatile oils in leaves and branches were 0.104% and 0.078%， respectively. Forty-five components were identified from the volatile oils in leaves， accounting for 92.63% of total volatile components. The major constituents included（1R）-α-pinene（34.50%）， germacrene B（22.82%）， germacrene D（5.46%）， viridiflorene（4.74%） and α-gurjunene（3.15%）. Forty-four components were identified from the volatile oils in branches， accounting for 95.51% of total volatile components. The major constituents included（1R）-α-pinene（43.86%）， δ-cadinene（7.93%）， l-caryophyllene（4.92%），（3aS，3bR，4S，7R，7aR）-7-methyl-3-methylidene-4-（propan-2-yl）octahydro-1H-cyclopenta[1，3]cyclopropa[1，2]benzene（4.91%）， 2-isopropyl-5-methyl-9-methylene[4.4.0]dec-1-ene（3.72%）， copaene（3.68%）， γ-cadinene（3.60%） and cyclosativene（3.04%）. The volatile oils in leaves and branches showed certain inhibitory activities to the tested bacteria， but the differences were not obvious. The volatile oil in leaves showed the strongest inhibitory activity against Agrobacterium tumefaciens and the inhibition zone diameter was 9.0±0.0 mm. While the branches volatile oil showed strongest inhibitory activities against Staphylococcus haemolyticus and Pseudomonas syringae， and inhibition zone diameters were both 8.3±0.6 mm. The methanol extracts from the leaves and branches showed sound inhibitory activity to the tested bacteria except for Ralstonia solanacearum， and the inhibitory activities of methanol extracts from leaves was stronger than that of methanol extracts from branches. 【Conclusion】The antibacterial substances in leaves and branches of P. fleuryi Hickel are mainly non-volatile substances， and can be developed as natural antibacterial substance resources.

Key words： Podocarpus fleuryi Hickel； volatile oil； chemical constituent； GC-MS； antibacterial activity

0 引言

【研究意義】長(zhǎng)葉竹柏（Podocarpus fleuryi Hickel）為羅漢松科竹柏屬常綠喬木，又名桐木樹(shù)、竹葉球等，生于海拔800～900 m的山地林中，主要分布于我國(guó)的云南東南部、廣西、廣東、海南和臺(tái)灣等地。其木材結(jié)構(gòu)致密，為上等的家具、建筑用材；種子含油較豐富，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高；樹(shù)形優(yōu)美，常作行道樹(shù)及園林綠化樹(shù)種（何道航等，2005； 張?zhí)m春，2013）。長(zhǎng)葉竹柏作為常見(jiàn)的園林綠化樹(shù)種很少受病蟲(chóng)為害，是否與自身產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)有關(guān)值得深入研究和探討。【前人研究進(jìn)展】目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)長(zhǎng)葉竹柏的研究較少且主要集中于葉片化合物成分和植株抗逆研究（齊代華等，2003a， 2003b）。徐亞明等（1990）根據(jù)理化性質(zhì)和波譜學(xué)方法從長(zhǎng)葉竹柏枝葉中鑒定出棕?cái)R酸、柳杉酚等11種成分，但未給出相關(guān)數(shù)據(jù)。何道航等（2005）采用水蒸氣蒸餾法提取長(zhǎng)葉竹柏葉片中的揮發(fā)油，通過(guò)氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）分析，共鑒定出24種化合物，其中主要成分為4-isopropylidene-1-vinyl-o-

Menth-8-ene（45.13%）、大根香葉烯（21.56%）、α-蒎烯（8.67%）、β-石竹烯（3.97%）、（-）-斯巴醇（3.15%）、（-）-β-欖香烯（2.68%）、（+）-喇叭烯（2.11%）和β-杜松烯（2.02%）。杜紅光（2008）采用水蒸氣蒸餾法分別提取竹柏和長(zhǎng)葉竹柏葉片中的揮發(fā)油，通過(guò)GC-MS分析，分別鑒定出13和29種化合物，主要成分為萜烯類和醇類物質(zhì)，但兩者揮發(fā)油GC-MS分析圖譜和成分存在明顯差異。劉娟（2015）對(duì)云南西雙版納的長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝干的化學(xué)成分進(jìn)行分離和鑒定，共分離鑒定獲得39種化合物，其中2種為新的甾體化合物；對(duì)分離獲得到的新甾體類化合物進(jìn)行了細(xì)胞毒活性研究，但未表現(xiàn)出活性。目前已有長(zhǎng)葉竹柏同屬植物竹柏葉片及枝條中揮發(fā)油的相關(guān)研究報(bào)道。胡文杰等（2014）用水蒸氣蒸餾法和GC-MS分析對(duì)竹柏葉片及其枝條中揮發(fā)油進(jìn)行分析，從竹柏葉片和枝條揮發(fā)油中各檢測(cè)出36 和43種成分，共檢測(cè)出52種物質(zhì)；竹柏葉片及其枝條揮發(fā)油中共有成分27種，但相對(duì)含量不同，如葉片中α-蒎烯含量為3.89%，而在枝條中的含量為20.77%?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】長(zhǎng)葉竹柏資源豐富，但尚未見(jiàn)其不同部位揮發(fā)油化學(xué)成分分析及其抗細(xì)菌活性的報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用水蒸氣蒸餾法提取長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條中的揮發(fā)油，運(yùn)用GC-MS分析其揮發(fā)油的化學(xué)組成并通過(guò)抑菌圈法測(cè)定其抗細(xì)菌活性，以確定長(zhǎng)葉竹柏不同部位揮發(fā)油的化學(xué)成分及相對(duì)含量，并探索其抑菌活性；采用薄層層析—生物自顯影法（TLC-生物自顯影）分別測(cè)定長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條甲醇提取物對(duì)供試細(xì)菌的抑制活性，以期為長(zhǎng)葉竹柏在農(nóng)林業(yè)上的應(yīng)用提供新思路。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

長(zhǎng)葉竹柏枝條和葉片于2014年7月18日采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)樹(shù)木園，植株生長(zhǎng)狀態(tài)良好，無(wú)病蟲(chóng)為害。標(biāo)本由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院鄭明軒老師鑒定。供試細(xì)菌包括5種革蘭氏陰性菌和2種革蘭氏陽(yáng)性菌，分別為根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens，G-）、大腸桿菌（Escherichia coli，G-）、桉樹(shù)青枯病菌（Ralstonia solanacearum，G-）、黃瓜角斑病菌（Pseudomonas lachrymans，G-）、番茄瘡痂病菌（Xantho-

monas vesicatoria，G-）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，G+）和溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus，G+），均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院森林保護(hù)教研室提供。

主要試劑：硫酸鏈霉素（美國(guó)Sigma公司）；C8～C40系列正構(gòu)烷烴（美國(guó)Sigma公司）；噻唑蘭（MTT）（美國(guó)Amresco公司）；氯化鈉、無(wú)水乙醚、無(wú)水硫酸鈉、正己烷等均為國(guó)產(chǎn)分析純（北京化學(xué)試劑公司）。主要儀器設(shè)備：6890N-5975C氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；水蒸氣蒸餾裝置（北京永光明醫(yī)療儀器廠）；RE5298A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮儀器廠）等。

1. 2 長(zhǎng)葉竹柏?fù)]發(fā)油提取

參照Lou等（2014）的方法并作適當(dāng)修改。分別采集長(zhǎng)葉竹柏的葉片和枝條，剪碎、稱重后裝入水蒸氣蒸餾裝置內(nèi)，加入適量蒸餾水，待溫度升至100 ℃后連續(xù)蒸餾6 h，收集蒸出的精油，加入一定量的NaCl，用無(wú)水乙醚萃取3次，萃取液合并，加入無(wú)水硫酸鈉進(jìn)行干燥，讓乙醚自然揮發(fā)，4 ℃密封保存。

1. 3 長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條揮發(fā)油化學(xué)組分分析

長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條揮發(fā)油化學(xué)組分鑒定在6890N-5975C GC-MS上進(jìn)行，色譜柱為DB-5（30 m×250 μm×0.25 μm），無(wú)分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度230 ℃，進(jìn)樣量1 μL。升溫程序：起始溫度70 ℃，保持1 min；8 ℃/min上升到120 ℃，保持1 min；30 ℃/min上升到150 ℃，保持1 min；5 ℃/min上升到175 ℃，保持0 min；1 ℃/min上升到180 ℃，保持0 min；5 ℃/min上升到240 ℃，保持0 min。電離方式為EI，電離能量70 eV，載氣為He，流速1 mL/min，全掃描采集，質(zhì)譜檢測(cè)器（MSD）檢測(cè)。通過(guò)NIST（2011）譜庫(kù)檢索，與標(biāo)準(zhǔn)化合物的保留時(shí)間和質(zhì)譜圖進(jìn)行比對(duì)，確定待測(cè)成分。

1. 4 長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條甲醇提取物制備

采用甲醇冷浸提取法分別提取長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條中的次生代謝產(chǎn)物。分別將長(zhǎng)葉竹柏的葉片和枝條剪碎，裝入1000 mL三角瓶中，加入適量甲醇，室溫下冷浸提取3次，每次7 d，濃縮提取液，水混懸后用乙酸乙酯連續(xù)萃取3次，濃縮萃取液即得到長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條的甲醇提取物，4 ℃冷藏，備用。

1. 5 長(zhǎng)葉竹柏次生代謝產(chǎn)物抗細(xì)菌活性測(cè)定

1. 5. 1 長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條揮發(fā)油抗細(xì)菌活性測(cè)定 長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條揮發(fā)油抗細(xì)菌活性測(cè)定參照趙文越等（2014）的方法并略有改進(jìn)。供試細(xì)菌先用LB 培養(yǎng)基活化培養(yǎng)（28 ℃，暗）48 h，然后挑取單菌落在LB液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)（28 ℃，暗，150 r/min）24 h，將菌液濃度稀釋至108 CFU/mL，備用。倒好培養(yǎng)基后，用移液槍分別吸取50 μL菌液，用玻璃棒涂抹均勻。用滅菌鑷子夾取無(wú)菌的濾紙片放在培養(yǎng)皿中，每皿放置3片，濾紙片間保持一定距離，然后分別在濾紙片上加入5 μL揮發(fā)油，陽(yáng)性對(duì)照為5 μL硫酸鏈霉素（0.2 mg/mL），每處理3次重復(fù)。在黑暗條件下培養(yǎng)24 h后用尺子量取抑菌圈直徑。

1. 5. 2 長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條甲醇提取物抗細(xì)菌活性測(cè)定 長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條甲醇提取物抗細(xì)菌活性測(cè)定參照Shan等（2012）的方法。將甲醇提取物溶解，用直徑0.5 mm的毛細(xì)管點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量為5 μL。采用二氯甲烷和甲醇作為展開(kāi)劑進(jìn)行薄層層析，薄層層析后在薄層板的一側(cè)原點(diǎn)處點(diǎn)5 μL硫酸鏈霉素（0.2 mg/mL）作陽(yáng)性對(duì)照，備用。向滅菌的LB半固體培養(yǎng)基（瓊脂濃度為0.5%）中加入一定量準(zhǔn)備好的菌液（45 mL LB+5 mL菌液），將其濃度調(diào)至約108 CFU/mL，振蕩、均勻。用噴樣器將制備好的菌懸液均勻噴灑到層析后的硅膠板上；待培養(yǎng)基在硅膠板上冷卻后，將硅膠板置于培養(yǎng)皿中于4 ℃冰箱中放置4 h，以利于抗菌成分的擴(kuò)散；然后將培養(yǎng)皿置于28 ℃下保濕培養(yǎng)，12 h后取出硅膠板，在其上均勻噴灑噻唑藍(lán)（MTT），約10 min后即可觀察試驗(yàn)結(jié)果。有抗菌活性成分處，供試菌由于受到抑菌成分的抑制而出現(xiàn)抑菌斑；無(wú)抗菌活性成分處，供試菌正常生長(zhǎng)，通過(guò)MTT顯色后出現(xiàn)背景色藍(lán)色。通過(guò)抗菌斑點(diǎn)的遷移率（Rf）初步評(píng)價(jià)樣品中抗菌化合物的數(shù)量和極性，根據(jù)抗菌斑點(diǎn)的大小初步評(píng)價(jià)化合物的活性和含量

Rf=■

2 結(jié)果與分析

2. 1 長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條揮發(fā)油化學(xué)成分分析結(jié)果

采用水蒸氣蒸餾法提取長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條中的揮發(fā)油，得率分別為0.104%和0.078%（以鮮重為基礎(chǔ)），說(shuō)明長(zhǎng)葉竹柏葉片中揮發(fā)油的含量遠(yuǎn)高于枝條。采用峰面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)百分含量，并對(duì)相對(duì)百分含量進(jìn)行定量分析，結(jié)果見(jiàn)表1。長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條揮發(fā)油總離子流圖見(jiàn)圖1和圖2。通過(guò)GC-MS分析發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條揮發(fā)油在化學(xué)組成和相對(duì)含量上均存在明顯差異。從長(zhǎng)葉竹柏葉片中共鑒定出45種成分，占總相對(duì)含量的92.63%，主要成分是（1R）-α-蒎烯（34.50%）、大根香葉烯B（22.82%）、大根香葉烯D（5.46%）、綠花烯（4.74%）和α-古蕓烯（3.15%），其相對(duì)含量之和為70.67%，其他成分相對(duì)含量均小于3.00%；在枝條中共鑒定出44種成分，占總相對(duì)含量的95.51%，其中主要成分是（1R）-α-蒎烯（43.86%）、δ-杜松烯（7.93%）、1-石竹烯（4.92%）、（3aS，3bR，4S，7R，7aR）-7-methyl-3-methylidene-4-（pro-

pan-2-yl）octahydro-1h-cyclopenta[1，3]cyclopropa[1，2]benzene（4.91%）、2-isopropyl-5-methyl-9-methylene[4.4.0]dec-1-ene（3.72%）、古巴烯（3.68%）、γ-杜松烯（-）-γ-蓽澄茄烯（3.60%）和蒜頭環(huán)烯（3.04%），其相對(duì)含量之和為75.66%；其他成分相對(duì)含量均小于3.00%。

從表1可進(jìn)一步看出，長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條揮發(fā)油主要以萜烯類和醇類為主，二者的主要成分均為（1R）-α-蒎烯，其相對(duì)含量分別為34.50%和43.86%，（1R）-α-蒎烯在枝條中的相對(duì)含量比葉片高9.36%（絕對(duì)值）。此外，大根香葉烯B和大根香葉烯D在葉片揮發(fā)油中的相對(duì)含量高達(dá)22.82%和5.46%，但在枝條中未檢測(cè)到；1-石竹烯、2-isopropyl-5-methyl-9-methylene[4.4.0]dec-1-ene、古巴烯、（3aS，3bR，4S，7R，7aR）-7-

methyl-＼3-methy-lidene-4-（propan-2-yl）octahydro-1h-

cyclopenta[1，3]、cyclopropa[1，2]benzene和蒜頭環(huán)烯作為枝條揮發(fā)油的主要成分，在葉片中也未檢測(cè)到。除（1R）-α-蒎烯外，長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條揮發(fā)油中相同的成分還有11種，分別為1-辛烯-3-醇、β-水芹烯、α-古蕓烯、α-石竹烯、綠花烯、γ-杜松烯、β-杜松烯、δ-杜松烯、naphthalene，1，2，3，4，4a，7-hexahydro-1，6-dimethyl-

4-（1-methylethyl）-、阿松香三烯和鐵銹羅漢柏醇，但α-古蕓烯、綠花烯和δ-杜松烯在葉片和枝條揮發(fā)油中的相對(duì)含量差別較明顯。

通過(guò)以上分析可知，長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條中均含有一定量的揮發(fā)油，雖然相對(duì)含量最高的成分均為（1R）-α-蒎烯，但不同部位的化學(xué)組成存在一定差異，因此要根據(jù)不同的需求，采集不同的部位進(jìn)行提取。

2. 2 長(zhǎng)葉竹柏次生代謝產(chǎn)物的抗細(xì)菌活性

2. 2. 1 長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條揮發(fā)油的抗細(xì)菌活性 長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條揮發(fā)油對(duì)7種供試細(xì)菌的抑制活性見(jiàn)圖3。從圖3可看出，長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條揮發(fā)油對(duì)不同供試細(xì)菌的抑制活性差異不明顯，但均弱于陽(yáng)性對(duì)照硫酸鏈霉素，其中葉片揮發(fā)油對(duì)根癌土壤桿菌的抑制活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為9.0±0.0 mm，而枝條揮發(fā)油對(duì)溶血葡萄球菌和黃瓜角斑病菌的抑制活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑均為8.3±0.6 mm。長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌均未表現(xiàn)出任何抗菌活性?；钚詼y(cè)定結(jié)果表明長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條揮發(fā)油對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌的抑制活性無(wú)明顯規(guī)律性。

2 .2. 2 長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條甲醇提取物的抗細(xì)菌活性 通過(guò)TLC-生物自顯影法測(cè)定長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條甲醇提取物的抗細(xì)菌活性，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出，陽(yáng)性對(duì)照硫酸鏈霉素對(duì)7種供試細(xì)菌的抑制活性與抑菌圈法測(cè)定的結(jié)果基本一致，對(duì)根癌土壤桿菌、番茄瘡痂病菌和溶血葡萄球菌的抑制活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑均大于10 mm。長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條甲醇提取物除對(duì)桉樹(shù)青枯病菌在Rf為0.00～1.00的范圍內(nèi)均未表現(xiàn)出抑菌活性外，對(duì)其余6種供試細(xì)菌均表現(xiàn)出較好的抑制活性，其中葉片甲醇提取物對(duì)供試細(xì)菌的抑制活性強(qiáng)于枝條。長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條甲醇提取物對(duì)供試細(xì)菌的最大抑菌斑直徑均在5～10 mm，但葉片甲醇提取物的抑菌斑多于枝條。以對(duì)根癌土壤桿菌的抑制活性為例，長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條甲醇提取物在Rf為0.00～0.25的范圍內(nèi)均表現(xiàn)出抑制活性，葉片提取物在Rf為0.62～0.63的范圍內(nèi)表現(xiàn)出較弱的抑制活性，枝條在Rf為0.60～0.67的范圍內(nèi)也表現(xiàn)出相應(yīng)的抑制活性；而葉片提取物在Rf為0.28～0.30和0.33～0.38的范圍內(nèi)抑菌斑直徑在0～5 mm，枝條提取物在此范圍內(nèi)未表現(xiàn)出抑制活性。長(zhǎng)葉竹柏葉片甲醇提取物對(duì)枯草芽孢桿菌、溶血葡萄球菌和大腸桿菌的抑制活性與對(duì)根癌土壤桿菌的抑制活性一樣，明顯強(qiáng)于枝條甲醇提取物；對(duì)番茄瘡痂病菌和黃瓜角斑病菌的抑制活性幾乎與枝條提取物一致。綜上所述，長(zhǎng)葉竹柏的甲醇提取物對(duì)供試細(xì)菌具有一定的抑制活性，且葉片提取物的抑制活性強(qiáng)于枝條提取物。

3 討論

自何道航等（2005）首次從長(zhǎng)葉竹柏葉片揮發(fā)油中鑒定出24種成分以來(lái)，尚未見(jiàn)長(zhǎng)葉竹柏枝條揮發(fā)油化學(xué)成分分析及長(zhǎng)葉竹柏?fù)]發(fā)油抗細(xì)菌活性的報(bào)道。本研究采用水蒸氣蒸餾法分別提取長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條中的揮發(fā)油，利用GC-MS從葉片揮發(fā)油中鑒定出45種成分，從枝條揮發(fā)油中鑒定出44種成分，首次闡明了長(zhǎng)葉竹柏枝條揮發(fā)油的化學(xué)組成及其相對(duì)含量。長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條揮發(fā)油雖然在化學(xué)組成和相對(duì)含量上存在明顯差異，但最主要的成分均為（1R）-α-蒎烯，其在葉片和枝條中的相對(duì)含量分別為34.50%和43.86%。而何道航等（2005）用水蒸氣蒸餾法提取長(zhǎng)葉竹柏葉片中的揮發(fā)油，通過(guò)GC-MS分析共鑒定出24種化合物，其中主要成分為4-isopropylidene-1-vinyl-o-

Menth-8-ene（45.13%）和大根香葉烯（21.56%）等，α-蒎烯的相對(duì)含量?jī)H占8.67%，低于本研究的34.50%，原因可能與植物生長(zhǎng)的地理環(huán)境、采集時(shí)間以及提取和純化方法等不同有關(guān)。胡文杰等（2014）研究發(fā)現(xiàn)竹柏葉片揮發(fā)油的主要成分為欖香烯（20.85%）、β-蓽澄茄油烯（15.50%）、3-崖柏烯（8.61%）和α-石竹烯（5.86%），而竹柏枝條揮發(fā)油的主要成分為α-蒎烯（20.77%）、大根香葉烯B（15.12%）、石竹烯（9.30%）、β-蓽澄茄油烯（8.07%）和δ-杜松烯（5.48%）。長(zhǎng)葉竹柏和竹柏雖然同屬于羅漢松科竹柏屬，但揮發(fā)油的化學(xué)組成和相對(duì)含量差別較大。

長(zhǎng)葉竹柏葉片揮發(fā)油中含量最多的α-蒎烯能合成樟腦酸酐和樟腦醌，具有殺蟲(chóng)和抑菌活性，也是許多種植物精油活性成分的重要組成部分（梁志華等，2013a，2013b；林立等，2015；吳恒等，2015）。α-蒎烯對(duì)白色念珠菌的生物合成有顯著的抑制作用，其通過(guò)抑制白色念珠菌細(xì)胞膜中麥角固醇、胞壁中幾丁質(zhì)、多糖的合成及抑制核酸DNA、RNA 的合成而起到殺菌作用（夏忠弟和余俊龍，2000）。本研究首次報(bào)道了長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條揮發(fā)油對(duì)不同供試細(xì)菌的抑制活性，結(jié)果表明，長(zhǎng)葉竹柏枝葉揮發(fā)油對(duì)供試細(xì)菌的抑制活性不強(qiáng)，而長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條的甲醇提取物表現(xiàn)出相對(duì)較強(qiáng)的抑制活性，可能與葉片和枝條中產(chǎn)生的非揮發(fā)性抗菌活性物質(zhì)有關(guān)。徐亞明等（1990）、徐亞明和方圣鼎（1991）從長(zhǎng)葉竹柏枝葉非揮發(fā)性成分中分離得到12種化合物，并經(jīng)藥理篩選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有2個(gè)雙內(nèi)酯化合物對(duì)白血病細(xì)胞P388有顯著的抑制作用；張春蘭（2013）從云南西雙版納的長(zhǎng)葉竹柏中分離得到具有較強(qiáng)細(xì)胞毒作用的二萜雙內(nèi)酯類化合物；但尚未見(jiàn)這些分離到的單體化合物對(duì)細(xì)菌抑制活性的報(bào)道。本研究結(jié)果表明，長(zhǎng)葉竹柏枝葉甲醇提取物中確實(shí)存在抗菌活性化合物，這些抗菌物質(zhì)是否為前人已分離到的單體化合物有待進(jìn)一步研究。TLC-生物自顯影法不僅可以快速靈敏地檢測(cè)植物粗提物中的抗菌活性物質(zhì)，還能通過(guò)薄層層析和Rf大小可對(duì)抗菌活性化合物的數(shù)目和極性有一定了解。

4 結(jié)論

長(zhǎng)葉竹柏葉片和枝條中均含有種類豐富的揮發(fā)油，主要以萜烯類和醇類為主，其中葉片揮發(fā)油的含量高于枝條；除桉樹(shù)青枯病菌外，長(zhǎng)葉竹柏枝葉甲醇提取物對(duì)其余6種供試細(xì)菌均表現(xiàn)出較好的抑制活性，其中葉片甲醇提取物對(duì)供試細(xì)菌的抑制活性強(qiáng)于枝條，說(shuō)明長(zhǎng)葉竹柏中的抗菌活性物質(zhì)主要為非揮發(fā)性物質(zhì)。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）