呂丁丁 侯成香 耿濤 黃玉霞 覃光星 高坤 郭錫杰

摘要：【目的】闡明家蠶（Bombyx mori）抗菌肽對球孢白僵菌感染的應(yīng)答模式，為揭示家蠶及鱗翅目昆蟲抗真菌機制提供參考依據(jù)?！痉椒ā坷脤崟r熒光定量PCR檢測家蠶被球孢白僵菌感染后抗菌肽基因cecropinA、gloverin2、lebocin1/2和lysozyme的表達(dá)情況，比較4種抗菌肽在家蠶脂肪體、血淋巴、馬氏管和中腸中不同時間點的表達(dá)差異?！窘Y(jié)果】經(jīng)球孢白僵菌誘導(dǎo)后，cecropinA基因在家蠶脂肪體中的最高上調(diào)表達(dá)倍數(shù)為10.2倍，在血淋巴中的最高上調(diào)表達(dá)倍數(shù)為13.2倍，在馬氏管中感染初期顯著上調(diào)表達(dá)（P<0.05，下同），在中腸中感染后期顯著上調(diào)表達(dá)；gloverin2基因在家蠶脂肪體中出現(xiàn)2次上調(diào)表達(dá)過程，最高上調(diào)表達(dá)倍數(shù)為15.7倍，在血淋巴中感染前期呈上調(diào)表達(dá)，在馬氏管中略呈下調(diào)表達(dá)，中腸中的gloverin2基因在接種后16～48 h呈顯著上調(diào)表達(dá)，最高上調(diào)表達(dá)倍數(shù)為6.7倍；lebocin1/2基因在家蠶脂肪體和血淋巴中的最高上調(diào)表達(dá)倍數(shù)分別為19.4和22.4倍，在馬氏管中僅在接種后16 h呈顯著上調(diào)表達(dá)，在中腸中則是接種后24～48 h呈顯著上調(diào)表達(dá)；lysozyme基因在家蠶脂肪體中顯著上調(diào)表達(dá)，在血淋巴和馬氏管中感染初期也呈顯著上調(diào)表達(dá)，但在中腸中的表達(dá)無明顯規(guī)律?！窘Y(jié)論】cecropinA、gloverin2、lebocin1/2和lysozyme基因在球孢白僵菌侵染家蠶的過程中均不同程度地被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，尤其在家蠶脂肪體和血淋巴中較明顯，由此推測這4種抗菌肽在抵御球孢白僵菌的侵染過程中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞： 家蠶；球孢白僵菌；抗菌肽；表達(dá)水平

中圖分類號： S884.31 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）11-1952-06

Abstract：【Objective】The present study was conducted to evaluate response pattern of antimicrobial peptides in Bombyx mori against Beauveria bassiana infection in order to provide beneficial reference for researches on antifungal mechanism of B. mori and other lepidoptera insects. 【Method】The expression patterns of antimicrobial peptide genes cecropinA， gloverin2， lebocin1/2 and lysozyme in B. mori after being infected with B. bassiana were detected using real-time fluorescence quantitative PCR. The differential expressions of the four antimicrobial peptide genes in fat body， hemolymph， malpighian tubule and midgut at different time points were compared. 【Result】After being induced by B. bassiana， the expression of cecropinA was up-regulated by 10.2 times to the maximum in fat body and 13.2 times to maximum in hemolymph. The expression of cecropinA was also significantly up-regulated in malpighian tubule at early stage of the infection（P<0.05， the same below）， and in midgut at middle-late stages of the infection. Up-regulated expression of gloverin2 occurred twice in fat body and the maximum re-regulated expression multiple was 15.7 times. The expression of gloverin2 up-regulated in hemolymph at earlier stage but down-regulated in malpighian tubule. It also up-regulated in mindgut after 16-48 hours of infection， with maximum up-regulated multiples reaching 6.7 times. The expression of lebocin1/2 up-regulated in fat body by 19.4 times to utmost limit and by 22.4 times to the maximum in hemolymph. It also up-regulated significantly in malpighian tubule after 16 hours of infection and in midgut after 24-48 hours of infection. The expression of lysozyme significantly up-regulated in fat body， and also significantly up-regulated in hemolymph and malpighian tubule at earlier stage of infection. But the expression in midgut showed no obvious regulation. 【Conclusion】The expressions of antimicrobial peptide genes cecropinA， gloverin2， lebocin1/2 and lysozyme up-regulated to different extents after B. mori infected by B. bassiana， especially in fat body and hemolymph of B. mori. The results suggest that cecropinA， gloverin2， lebocin1/2 and lysozyme may play important roles in B. mori antifungal process against B. bassiana infection.

Key words： Bombyx mori； Beauveria bassiana； antimicrobial peptide； expression characteristics

0 引言

【研究意義】家蠶（Bombyx mori）的先天性免疫系統(tǒng)包括細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。體液免疫應(yīng)答主要是合成和釋放若干抗微生物肽分子，而這些抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）均產(chǎn)生于脂肪體、血細(xì)胞及上皮組織（呂鴻聲，2008）。家蠶抗菌肽在正常情況下不表達(dá)或呈低水平的組成型表達(dá)，一旦有外界微生物入侵，即在體內(nèi)迅速合成與釋放，參與免疫反應(yīng)。白僵病是危害最嚴(yán)重、病勢最急的一種家蠶真菌性傳染?。▍硒櫬暤?，1990），研究家蠶抗菌肽對球孢白僵菌（Beauveria bassiana）感染的應(yīng)答模式，對闡明家蠶對白僵菌的體液免疫機制及其防治具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】自1981年Boman和Steiner在惜古比天蠶（Hyatophora cecropia）中發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)抗微生物肽以來，目前已從家蠶中分離鑒定出多種可誘導(dǎo)抗菌肽，如cecropins、defensins、lebocins、gloverins等（Yamano et al.，1994；Chowdhury et al.，1995；Cheng et al.，2006；Kaneko et al.，2007， 2008）。當(dāng)昆蟲受到免疫刺激時，溶菌酶（lysozymes）在其體內(nèi)含量迅速升高，并參與免疫應(yīng)答，因此也常被視為免疫分子（呂鴻聲，2008）。目前，已有研究證實家蠶抗菌肽對革蘭氏陽性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌均有抑菌作用（Zhang et al.，1999；Cheng et al.，2006；Xia et al.，2013；姚遠(yuǎn)等，2014），但能抑制真菌的家蠶抗菌肽僅有cecropin類，如化學(xué)合成的cecropin多肽對馬鈴薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）等植物病原真菌具有較強的抑菌作用（Cavallarin et al.，1998），而原核表達(dá)的家蠶cecropinA在體內(nèi)外對昆蟲病原真菌球孢白僵菌均具有抗菌作用（Lu et al.，2016）?！颈狙芯壳腥朦c】家蠶cecropin類抗菌肽能被革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌及真菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，但不能被病毒誘導(dǎo)表達(dá)（Cheng et al.，2006；Hong et al.，2008）；家蠶脂肪體、馬氏管組織中的gloverin基因能被大腸桿菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)（Kaneko et al.，2007），中腸中的gloverin基因能被家蠶核型多角體病毒誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)（唐芬芬等，2015）；家蠶脂肪體、中腸、馬氏管、血淋巴中的lebocin基因被大腸桿菌誘導(dǎo)后顯著上調(diào)表達(dá)（Tanaka et al.，2012）；家蠶脂肪體、血淋巴和表皮中的lysozyme基因能被革蘭氏陽性細(xì)菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)（Lee and Brey，1995）。但這4類抗菌肽在家蠶不同組織中被真菌誘導(dǎo)表達(dá)的機制研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以球孢白僵菌接種家蠶后，利用實時熒光定量PCR檢測家蠶體內(nèi)抗菌肽基因cecropinA、gloverin2、lebocin1/2、lysozyme的表達(dá)情況，比較4種抗菌肽在家蠶脂肪體、血淋巴、馬氏管和中腸中不同時間點的表達(dá)差異，闡明家蠶抗菌肽對球孢白僵菌感染的應(yīng)答模式，為揭示家蠶及鱗翅目昆蟲抗真菌機制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試家蠶品種p50由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所保存并飼養(yǎng)。球孢白僵菌HN6菌株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所病理室保存提供，其寄主是家蠶，試驗前經(jīng)家蠶復(fù)壯。Taq DNA聚合酶、RNApure Ultrapure Total RNA Extraction Kit購自北京博凌科為生物科技有限公司；Ex Taq■、RNAiso Plus、PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit、DNA Ligation Kit Ver.2.1、SYBR Premix Ex TaqTM Kit等購自TaKaRa公司。

1. 2 球孢白僵菌接種及家蠶組織收集

HN6菌株在PDA培養(yǎng)基中25 ℃培養(yǎng)7～10 d后，用小鑰勺將培養(yǎng)基上的孢子刮取到200.0 mL含0.01% Tween-20的滅菌ddH2O中，漩渦振蕩至孢子分散，再用加有3層無菌脫脂棉的50.0 mL注射器過濾孢懸液，對過濾獲得的孢懸液進行梯度稀釋并計數(shù)，將其濃度調(diào)至1×108個/mL。試驗組取350頭5齡起蠶，在孢懸液中浸泡接種15 s后迅速撈起并濾去多余的孢懸液，放置在正常環(huán)境進行飼養(yǎng)；對照組的350頭家蠶在含0.02% Tween-20的滅菌ddH2O中浸泡15 s。為防止細(xì)菌感染家蠶，孢懸液和對照品的無菌水均添加青霉素—鏈霉素混合溶液。

分別于接種后8、12、16、20、24、30、36、42、48和54 h取材，試驗組和對照組設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)取10頭家蠶。首先將家蠶置于冰上2 min，剪去一只腹足，收集血淋巴，裝入含0.5 mL RNAiso Plus的凍存管中，再將家蠶固定到解剖臺上，分別解剖收集脂肪體、馬氏管和中腸，組織樣品均用0.9%生理鹽水浸泡洗滌，再裝入含0.5 mL RNAiso Plus的凍存管中。裝有組織樣品的凍存管先放入液氮中速凍，然后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 總RNA提取及cDNA第一鏈合成

將各組織樣品自然解凍，加入200 μL RNAiso Plus，置于冰上用勻漿機充分勻漿破碎，加入RNAiso Plus，血淋巴樣品需用1.0 mL注射器反復(fù)吹打，再根據(jù)RNApure超純總RNA快速提取試劑盒說明提取總RNA，檢測RNA濃度、純度及其完整性。調(diào)整各樣品組織總RNA濃度，根據(jù)PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒操作說明合成cDNA第一鏈，并以管家基因actin引物對cDNA模板進行PCR檢測。

1. 4 選取靶基因及其引物設(shè)計

針對家蠶的cecropin類抗菌肽，選取cecropinA基因（NM_001043997.1）為靶基因；針對gloverin類抗菌肽，選取gloverin2基因（NM_001044218.2）為靶基因；針對lebocin類抗菌肽，選取lebocin1/2基因（NM_001044003.1）為靶基因；針對lysozyme類抗菌肽，選取lysozyme基因（L37416.1）為靶基因。根據(jù)實時熒光定量PCR引物設(shè)計原則，利用Primer Premier 5.0對4個抗菌肽基因進行引物設(shè)計（表1），以家蠶管家基因actinA3（NM_001126254.1）為內(nèi)參基因。

1. 5 實時熒光定量PCR檢測

實時熒光定量PCR反應(yīng)體系20.0 μL：10.0 μL 2×SYBR Premix Ex Taq，0.4 μL 50×ROX Reference Dye，0.5 μL正、反向引物（10 μmol/L），1.0 μL稀釋100倍的cDNA模板，ddH2O補足至20.0 μL。擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 5 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 40 s，進行45個循環(huán)。然后按照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒說明在Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System上進行檢測，每個樣品重復(fù)3次。獲得的試驗數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進行分析（Livak and Schmittgen，2001）。

1. 6 統(tǒng)計分析

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果以RQ Study Application Version 1.4進行分析，并采用SPSS 19.0進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 球孢白僵菌對家蠶的感染致病情況

5齡家蠶在接種球孢白僵菌HN6菌株后48 h開始有部分家蠶體表出現(xiàn)油斑，食欲下降，并伴有吐液現(xiàn)象，約在接種后80 h試驗組的所有家蠶體表均出現(xiàn)大面積油斑（圖1-B），瀕臨死亡，至96 h后試驗組家蠶全部死亡。隨機挑選5頭死亡家蠶穿刺腹足采集血淋巴鏡檢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)死亡家蠶血淋巴中有大量球孢白僵菌的芽生孢子和營養(yǎng)菌絲（圖1-A）。將病蠶尸體放在保濕的培養(yǎng)皿中3～4 d后，所有蠶尸體表面布滿白色菌絲和孢子（圖1-C）。對照組家蠶未出現(xiàn)油斑和死亡現(xiàn)象，且能正常結(jié)繭化蛹。

2. 2 接種球孢白僵菌對家蠶cecropinA基因相對表達(dá)水平的影響

以實時熒光定量PCR檢測球孢白僵菌感染后家蠶脂肪體、血淋巴、馬氏管和中腸4個組織中cecropinA基因的相對表達(dá)水平，將各時間點對照組家蠶cecropinA基因的相對表達(dá)量設(shè)為1.0。當(dāng)靶基因的相對表達(dá)量大于1.0時即為上調(diào)表達(dá)，反之為下調(diào)表達(dá)。從圖2可看出，接種球孢白僵菌后，家蠶脂肪體中cecropinA基因于接種后20 h上調(diào)表達(dá)約10.2倍，然后表達(dá)水平回落；在血淋巴中cecropinA基因的相對表達(dá)水平顯著上調(diào)（P<0.05，下同），接種后8、24和54 h的表達(dá)水平分別上調(diào)約9.5、13.2和12.1倍，說明家蠶在抵御球孢白僵菌侵染過程中，其脂肪體和血淋巴中的cecropinA抗菌體發(fā)揮了重要作用。cecropinA基因在馬氏管中也呈上調(diào)表達(dá)，但上調(diào)表達(dá)水平?jīng)]有在脂肪體和血淋巴中的明顯，且隨著時間的推移上調(diào)表達(dá)水平逐漸下降，至接種后24 h時甚至呈下調(diào)表達(dá)；在中腸中，cecropinA基因初期呈下調(diào)表達(dá)，之后明顯上調(diào)表達(dá)，但上調(diào)倍數(shù)不及脂肪體和血淋巴。說明家蠶馬氏管中cecropinA抗菌體在感染初期可能對抵御球孢白僵菌起到一定作用，而中腸中的cecropinA抗菌體在感染中后期對抵御球孢白僵菌可能起到重要作用。

2. 3 接種球孢白僵菌對家蠶gloverin2基因相對表達(dá)水平的影響

從圖3可看出，在球孢白僵菌的誘導(dǎo)下，家蠶脂肪體和中腸中g(shù)loverin2基因的相對表達(dá)水平絕大部分時間點呈顯著上調(diào)表達(dá)，尤其在脂肪體中g(shù)loverin2基因的最高上調(diào)表達(dá)為15.7倍；在感染初期，中腸中該基因的上調(diào)表達(dá)水平逐漸提高，至接種后20 h達(dá)最高上調(diào)表達(dá)倍數(shù)（6.7倍），然后上調(diào)表達(dá)水平逐漸回落。在血淋巴中的gloverin2基因僅在接種后12～30 h呈顯著上調(diào)表達(dá)，且上調(diào)表達(dá)倍數(shù)不及在脂肪體和中腸中的表達(dá)水平高，其他時間點略呈下調(diào)表達(dá)。在馬氏管中，gloverin2基因未被球孢白僵菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，而略呈下調(diào)表達(dá)。球孢白僵菌的感染可能激活了家蠶脂肪體、中腸、血淋巴中g(shù)loverin2基因的轉(zhuǎn)錄，翻譯合成大量gloverin抗菌肽以抵御入侵的球孢白僵菌，而家蠶馬氏管中g(shù)loverin2基因可能未參與抵御過程。

2. 4 接種球孢白僵菌對家蠶lebocin1/2基因相對表達(dá)水平的影響

由圖4可看出，在球孢白僵菌誘導(dǎo)下，從接種后16 h起家蠶脂肪體中l(wèi)ebocin1/2基因的表達(dá)水平均顯著上調(diào)表達(dá)，最高上調(diào)倍數(shù)達(dá)19.4倍（接種后24 h），高于cecropinA和gloverin2基因在脂肪體中的最高上調(diào)表達(dá)倍數(shù)。在血淋巴中，lebocin1/2基因在接種后8～42 h也呈顯著上調(diào)表達(dá)，最高上調(diào)表達(dá)倍數(shù)（22.4倍）也高于cecropinA（13.1倍）和gloverin2基因（2.6倍），說明lebocin1/2抗菌肽在家蠶抵御球孢白僵菌的體液免疫過程中發(fā)揮重要作用。lebocin1/2基因在馬氏管中僅在接種后16 h上調(diào)2.8倍，可能在家蠶馬氏管中l(wèi)ebocin1/2基因沒有或未全程參與抵御球孢白僵菌的免疫應(yīng)答過程。在中腸免疫應(yīng)答中，lebocin1/2基因可能在接種后24～48 h參與了免疫應(yīng)答。

2. 5 接種球孢白僵菌對家蠶lysozyme基因相對表達(dá)水平的影響

由圖5可看出，在球孢白僵菌的誘導(dǎo)下，家蠶脂肪體中l(wèi)ysozyme基因從接種后16 h開始呈顯著上調(diào)表達(dá)，且出現(xiàn)兩個上調(diào)表達(dá)高峰，最高上調(diào)表達(dá)倍數(shù)為4.6倍；在血淋巴中，lysozyme基因初期呈顯著上調(diào)表達(dá)，然后上調(diào)表達(dá)水平逐漸回落；在馬氏管中l(wèi)ysozyme基因也是初期逐漸上調(diào)表達(dá)，至接種后24 h達(dá)最高上調(diào)表達(dá)水平，然后上調(diào)表達(dá)水平逐漸回落；lysozyme基因在中腸中的表達(dá)無明顯規(guī)律，僅在個別時間點呈上調(diào)表達(dá)，大部分時間點呈下調(diào)表達(dá)。在家蠶抵御球孢白僵菌的免疫反應(yīng)中，lysozyme基因的相對表達(dá)變化雖然不及cecropinA、 gloverin2和lebocin1/2基因明顯，但其在抵御球孢白僵菌入侵過程中也發(fā)揮了重要作用，尤其在脂肪體和血淋巴中。

3 討論

正常情況下，球孢白僵菌約在接種感染8 h后能侵入家蠶體表。因此，本研究從球孢白僵菌孢懸液侵染家蠶8 h后開始取材，動態(tài)觀察球孢白僵菌在整個侵染致病過程中對家蠶抗菌肽基因表達(dá)的影響，結(jié)果表明，在家蠶脂肪體中，接種后8和12 h兩個時間點gloverin2、lebocin1/2和lysozyme基因均未表現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)，cecropinA基因雖呈上調(diào)表達(dá)，但上調(diào)表達(dá)倍數(shù)不高；在血淋巴中，接種后8和12 h兩個時間點4種抗菌肽均呈顯著上調(diào)表達(dá)，說明血淋巴中的抗菌肽最先被誘導(dǎo)合成，進而快速參與免疫應(yīng)答過程，而脂肪體中抗菌肽需在接種后16 h才開始顯著上調(diào)表達(dá)，然后分泌到血淋巴中，以抵御入侵的球孢白僵菌。

雖然4種抗菌肽在球孢白僵菌的誘導(dǎo)下均能上調(diào)表達(dá)，但在脂肪體和血淋巴中，lebocin1/2基因的上調(diào)表達(dá)水平明顯高于cecropinA、gloverin2和lysozyme基因，說明在抵御球孢白僵菌侵染過程中，lebocin1/2抗菌肽可能發(fā)揮了更重要的作用。Rao等（2012）研究表明，化學(xué)合成的lebocin短肽對致病真菌新型隱球酵母（Cryptococcus neoformans）有明顯的抑菌活性。因此，在家蠶抗真菌機制及蠶藥研發(fā)中可將lebocin1/2基因作為一個重要的研究對象。在家蠶中腸中，球孢白僵菌能誘導(dǎo)抗菌肽上調(diào)表達(dá)，說明感染球孢白僵菌能引起家蠶腸道的免疫反應(yīng)，且gloverin2和lebocin1/2抗菌肽可能在腸道免疫中發(fā)揮了更重要的作用。在家蠶馬氏管中，除lysozyme基因外，其他3種抗菌肽基因?qū)η蜴甙捉┚恼T導(dǎo)應(yīng)答不明顯，大多數(shù)時期呈下調(diào)表達(dá)。McGettigan等（2005）研究報道，果蠅馬氏管能獨立于脂肪體，且作為自主免疫組織能被細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)抗菌肽。因此，推測在家蠶抵抗微生物入侵的過程中，發(fā)揮免疫的組織主要是脂肪體、血淋巴和中腸。

本研究還發(fā)現(xiàn)，除血淋巴的cecropinA基因在接種后54 h仍處于持續(xù)上調(diào)表達(dá)趨勢外，其他3種抗菌肽在脂肪體、血淋巴、中腸感染后期均呈上調(diào)表達(dá)水平逐漸回落趨勢，推測在感染后期，球孢白僵菌在家蠶體內(nèi)的增殖抑制了家蠶的一系列免疫保護反應(yīng)，或是家蠶自身為防止過度免疫而造成的現(xiàn)象（Welchman et al.，2009）。不同家蠶組織在感染球孢白僵菌后，4種抗菌肽基因相對表達(dá)水平隨時間的變化也不同，說明不同組織對球孢白僵菌有不同的防御機制，即對外來微生物的抵御是一個多免疫組織與多免疫因子協(xié)作的過程。家蠶被球孢白僵菌感染后，cecropinA、gloverin2、lebocin1/2和lysozyme等4種抗菌肽基因均被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，故推測這4種抗菌肽對球孢白僵菌具有一定的抑殺作用。本課題組前期已證明，用原核表達(dá)和化學(xué)合成的抗菌肽cecropinA在體內(nèi)和體外對球孢白僵菌均具有較強的抑制作用（Lu et al.，2016），但關(guān)于lebocin1/2、gloverin2和lysozyme抗菌肽是否對球孢白僵菌具有抑殺作用，尚需進一步研究證實。

4 結(jié)論

cecropinA、gloverin2、lebocin1/2和lysozyme基因在球孢白僵菌侵染家蠶的過程中均不同程度地被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，尤其在家蠶脂肪體和血淋巴中較明顯，由此推測這4種抗菌肽在抵御球孢白僵菌的侵染過程中發(fā)揮重要作用。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）